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雅酶IP/Co-IP 实验相关产品

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发表时间:2021-06-15 14:13作者:诺扬生物


IP/Co-IP的实验过程

      Co-IP可以寻找到抱在一起的两个蛋白分子,值得注意的是,Co-IP不能区分两个蛋白之间是直接接触、或是通过第三者做桥梁而间接接触。

      如图,A蛋白和B蛋白形成一个复合体结构,他们可以是直接抱团,也可以通过C分子作为桥梁,形成复合体。

微信图片_20210615142201.png


IP/Co-IP 实验的重要原则

      首先,最重要的原则:保持Co-IP样品的一致性。一般来说,Input的误差控制在WB检出差异的范围以下。

      其次,要考虑buffer的盐离子浓度。通常来说,真实存在的蛋白复合体能耐受生理盐(0.15M)以及更高的盐浓度,即在生理盐浓度下不会解体。所以,一般不推荐使用盐离子低于0.15M的buffer,除非蛋白相互作用比较弱。

      另一方面,很多情况下,两个蛋白的相互作用的数据是通过过表达发现的。这时候,最好能做标签蛋白如GFP,flag等的knock-in的细胞,也可以在感染靶细胞时适当的降低慢病毒的感染滴度,使目的蛋白的表达水平维持在内源水平,在进行后续的Co-IP。



简化实验—提高IP检测效率的方法

       对内源蛋白的Co-IP实验,首先要确定手上的抗体是否工作。商品化的一些抗体官网说能够做IP,但在亲自测试的时候却不对。这时候,想必大多数同学都会怀疑自己的不好。以笔者经验来谈,最大可能就是抗体不好。此时,考虑换一个牌子的抗体是最好的,以免耽误实验进度,岁月不等人啊。其次,有时间的可以琢磨一下,是不是细胞没表达该抗原啊?是不是抗原是跨膜蛋白,在裂解细胞后不存在上清相中(这点可通过WB检测Input中是否存在目的蛋白来排除)?

      一个重要的考虑因素是蛋白的大小,尤其蛋白已知。当蛋白分子量接近55KDa或25KDa附近的时候,问题会比较复杂。因为在最后一步洗脱的过程,很容易将抗体的轻链和重链带入到IP终产物,它将严重干扰实验结果。


IP/Co-IP 的实验疑问解决方案

       1、 IP外源tagged蛋白,洗脱尽量用相应的peptide竞争洗脱。此外,Flag、HA-beads通常是鼠抗,那么WB选用的蛋白的抗体应该选用非鼠抗—即选择异种抗体配合IP/WB实验。

       2、 IP内源性蛋白,尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脱或者SDS LB煮beads(后者抗体的重、轻链会更严重被洗脱),如蛋白为60KDa即能与55KDa重链分开时,且抗体效价许可的前提下,降低Co-IP实验中抗体投入量会显著减弱重、轻链信号,从而不会使得B蛋白信号在WB显影过程中被重链信号吞没;配合异种来源的抗体用作下游WB实验,即Co-IP 中使用的抗体为兔抗时,下游WB 实验蛋白选用非兔抗,如鼠抗、羊抗;反之亦然。笔者之前证明某蛋白与微管蛋白tubulin相互作用的实验中,由于tubulin分子大小在55KDa附近,完美的与抗体重链重合,试过用轻链特异的二抗来解决这个问题,但都失败了。最后,就是换用异种来源的抗体配合WB实验,解决了重链干扰问题。所以,强烈推荐此方法。


       其他一些问题如beads的封闭等也很重要,但都相当琐碎。这些琐碎的事就交给雅酶吧!相信小伙伴们在充分理解以上几点后,配合雅酶的经典Protein A/G IP/Co-IP kit,在以后的实验中可以做到百战百胜。雅酶现在推出的这款Protein A/G IP/Co-IP kit,完美解决了buffer、磁珠等的优化问题,能胜任大多数IP/Co-IP实验。效果媲美进口的同类型kit,价格优美。


IP/Co-IP 产品信息一览表

产品名称   

产品价格

YJ201

经典Protein A/G 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

1198

YJ202

基础免疫(共)沉淀试剂盒

40T

598

YJ203

Protein A 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

1198

YJ204

Protein G 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

1198

YJ205

HA 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

2198

YJ206

Myc 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

2198

YJ207

Flag 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

2198

YJ208

Flag 免疫(共)沉淀试剂盒(凝胶)

40T

2198

YJ209

GST 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

2198

YJ210

His 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

2198

YJ211

GFP 免疫(共)沉淀试剂盒

40T

2198

                                              即日起:凡定购雅酶任意IP-CoIP试剂盒均赠送雅酶1.5/2.0ml 16孔磁力架一个!


实验效果

微信图片_20210615145458.png

雅酶 Protein A/G 磁珠与 β-catenin 抗体结合,将 β-catenin 蛋白及其结合蛋白 TCF-4 捕获。

阳性对照组(Input 组) 为直接利用兔抗 β-catenin 抗体(或鼠抗 TCF-4 抗体)对细胞裂解液进行 WB 检测;阴性对照组(IgG 组)为正常兔 IgG。











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