MiRNA纯化与检测产品专题

▶背景介绍

       microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt。成熟的miRNA 5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约70～90nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶点mRNA，通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA及其靶mRNA之间的作用机制。

       检测miRNA目前常用荧光定量方法检测，根据反转录的不同分为加A法和颈环法。

miRNA提取试剂盒   miRNA Purification Kit

       miRNA提取试剂盒专用于从各种动物组织、 植物组织、 细胞、 血清、 血浆等样本中分离纯化miRNA， 还可以提取siRNA，snRNA等其他小于200nt的小分子RNA，同时也可用于总RNA的提取。本品将酚/胍裂解技术和硅基质膜纯化技术相结合，独特的裂解液在有效抑制RNases的同时，可以通过有机抽提的方法除去细胞或组织样品中的大部分DNA和蛋白。对于一些敏感的下游实验中，如需富集miRNA可适用该试剂盒单独对miRNA进行富集。本品适用样本范围广，制备的RNA纯度高，可直接用于敏感的下游应用，如Northern Blot分析，Real-Time PCR，Microarray Analysis等。

miRNA cDNA第一链合成试剂盒   miRNA cDNA Synthesis Kit

       本试剂盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾的方法来使miRNA具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终合成miRNA对应的第一链cDNA。

　　miRNA cDNA第一链合成试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)尾修饰过程及修饰后逆转录过程需要的全部试剂。该试剂盒具有非常高的Poly(A)修饰和逆转录效率，可以从1 ng-2 μg的total RNA中有效获得miRNA对应的cDNA第一链。并且操作简便、快捷，可以用于从一个反应合成的cDNA中同时检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量。

       备注：本试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒（CW2142）配套使用。

      自备实验材料：1 ng-2 μg的总 RNA，或0.1 ng-1 μg的小分子RNA。

PCR检测

miRNA荧光定量PCR检测试剂盒   miRNA qPCR Assay Kit

      本试剂盒包括检测所需的2×miRNA qPCR mix 和Reverse primer.

注：
Forward Primer设计原则，这样就两个引物都解决了。
1．遵循引物设计的最普遍原则。
2．以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。
3．试剂盒中提供的下游引物的Tm值为63.6℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在   63.6℃左右。
4．若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱 基（最好为G或C碱基）；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
5．若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个 碱基。