MBL-RIP/RBP相关抗体常见问题

——RIP-Assay Kit/RIP-Assay Kit for microRNA

• 实验中所需的细胞数为多少？

→取决于细胞类型，一般1个样品准备4×10⁶~2×10⁷个细胞。建议首先使用1×10⁷个细胞进行试验。

• 可使用自制抗体进行RIP分析吗？

→RNP的免疫沉淀能力根据抗体有所差异。最好使用纯化抗体，并且需要对最佳缓冲液条件进行摸索。（是否添加了high salt solution等）根据MBL迄今为止的研究发现，及时通过IP确认了RBP沉淀，也有可能出现RNA没有共同沉淀的情况。因此，建议使用生物分析仪（Bioanalyzer）和分光光度计（Nanodrop）来确认RNA是否被回收。

•可以使用Tag抗体进行RIP分析吗？

→已经证实，MBL的抗Myc-tag抗体（货号M047-3,克隆：PL14）可用于RIP分析。

• 可以使用磁珠吗？

→对于蛋白A和蛋白G，可以使用MBL的Protein G-Magnetic Beads（货号MJS002V2）或Dynabeads®（Thermo Fisher Scientific k.k.）

• 关于RIP-Assay Kit中使用的磁珠，有何推荐和注意事项吗？

→使用琼脂糖珠时，根据交联的程度（强度）可能会出现背景增高。我们建议使用Protein A（或G）Sepharose® CL-4B（GE公司）、Pierce™Protein G Plus Agarose（Thermo Fisher Scientific k.k.产品编号：22852）

• 可以分离核内的RBP簇吗？

→RIP-Assay Kit旨在分析“细胞质内的RNP”。RIP-Assay Kit的缓冲条件是基于细胞质/膜级分制备方法而开发的，几乎不破坏细胞核，因此基本上不可能回收核内的RNP。RIP-Assay Kit不支持诸如UV之类的交联方法。需要用户自行研究调整试验方案。

• 是否支持诸知交联（Cross-linking）之类的方法?

→ RPAsay 闭t不支持诸如UV之类的交联方法。需要用户自行研究调整实验方案。

• 在组织样本中可以使用吗?

→可以。为避免RNA降解，请在组织改集后至裂解液制备之前迅建进行操作，当冷冻储存时，优选在液氮中速冻。

• RIP-Assay Kit formicroRMA 和RIP-Assay Kit有什么区别?

→RIP-Assay Kit无法回收小RNA。RIP-Assay Kit for miroRNA可以回收小RNAR和大RMA。并且，能够分别回收小RNA大RNA，或者只回收小RNA。通过回收与RBP/大RNA结合的小RNA，可以了解细胞内活动通过RBP和小RMA如何进行调节。此外，对于miRNA的靶标识别也十分有用。


• 请介绍最有效地获取miRNA的提取方法。
→
如果混入大RNA也没有问题的话，请用两步法进行提取。可以将损耗控制到最低。如果想超免大RNA的混入，请用分离法或一步法进行提取。

——RiboTrap Kit

• RiboTrap与EMSA（电泳迁移分析法）有什么区别?
→ RiboTrap法用于检测与特定RNA结合的蛋白质。不仅可以鉴定出已知的RNA结合蛋白（RBP），还可以鉴定出未报告的RBP。而EMSA法主要用于检测具有特定碱基序列的核酸与蛋白质间的结合。

• 如何合成BrU标记RNA?
→ 进行体外转录时，通过将BrUTP以固定比例添加到反应底物中来合成BrU标记的RNA，建议BrUTP和UTP的摩尔比为上1:1～1:3。最合适的摩尔比需要考虑到RNA序列中的尿嘧啶含量。如果要在特定位置进行BrU标记，我们建议您使用合成寡核苷酸。

• BrU标记会干扰RNA与蛋白质结合吗?
→ 根据使用的RNA序列，有可能会出现干扰情况。

• 使用RiboTrap Kit进行试验时，大约需要多少细胞呢?
→大约1个样本7～10×10⁷个细胞。

• 3种洗涤缓冲液有什么区别?
→·Wash BuferI∶在3种中成分最温和，既可以去除结合能力较强的蛋白质，也可以去除较弱的蛋白质。缺点是肯景会增加一些。
·Wash Buffe II∶因离子强度较高，所以能够优先提取与RNA括合能力较强的蛋白质。
·Wash BafferIII∶强效洗涤剂，会减少间接结合的蛋白质数量。
请程据实验的目的进行选择。我们建议您第一次使用Wash BuferL.

——BRIC Kit

• 有什么方法可以检查要使用细胞的BrU标记效率?
→对BrU脉冲标记的细胞进行流式细胞分析，或者在制备total RNA后进行RNA IP，Dot blot，ELISA，以上方法均可以确认标记效率。

• BrU无法有效的掺入要使用的细胞。
→请重新确认下BrU脉冲标记浓度以及脉冲和回收的时间，Bru的浓度高于500uM时，BrU的毒性会给细胞带来不良影响。

• BRIC未能回收到BrU标记的RNA。
→请检查是否设定了最佳的BrU脉冲浓度，脉冲、回收时间，特此之外，还应确认input量、抗体量、磁珠增量。