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MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS[Wako] 二维码
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发表时间：2020-10-21 16:02作者：诺扬生物
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10,000×g离心后的上清。 该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。 细胞膜表面磷脂酰丝氨酸的亲和方法  Tim4蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡 ◆优点・特色
使用新型亲和纯化方法
无需进行超滤 ● 使用磁珠改进了操作 ● 流程优化 ※ 高重复性
样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。 ● 可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡 ● 可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡 ● 重复性高，回收量稳定 ● 简易操作（约3.5小时） ● 启用多个样品（无需超速离心） ◆产品列表
*每套试剂盒能完成5次回收实验，即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit ◆案例•应用 从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析 从人血清中提取外泌体的产量比较 使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。
● 检测抗体 抗CD9兔多抗，System Bioscience公司 抗CD63兔多抗，System Bioscience公司 ● 免疫印迹（WB）数据 各样品结果相当于150μL的血清样本。从100μL提取物中取出15μL，添加5μL的4×SDS样品缓冲液，全部上样。
从人EDTA血浆中提取外泌体 分别从1mL的EDTA血浆、EDTA血浆（超滤更换缓冲液）、人血清中提取外泌体，进行WB检测（抗Flotillin2抗体）。
● 检测抗体 抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司 ● 使用样品量 各1mL ● 免疫印迹（WB）数据 各样品结果分别对应150μL样品量。从100μL提取物中取出15μL，添加5μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。 从人尿液中提取外泌体的回收量比较 1mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗CD9抗体）。
● 检测抗体 抗CD9兔多抗，System Biosciences公司 ● 使用样品量 各1mL ● 免疫印迹（WB）数据 各样品结果分别对应150μL尿液样品。从100μL提取物中取出15μL，加入5μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。 ◆与传统沉淀法的功能比较实验 分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】 按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中提取外泌体。 超速离心法 将10mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）进行超离（110,000×g，70min），用TBS缓冲液重悬沉淀物后，再进行超离（110,000×g，70min），回收沉淀部分。 聚合物沉淀法 从1mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。 ※1：110,000×g离心2小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。
比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米粒子追踪（NTA）分析结果 分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外，用最终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（2~4×1010 particles），在透射电子显微镜进行分析。
电子显微镜图像 数据提供：金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生 MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。
K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基） 用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体）进行实验。
回收量，不是回收率 ● 检测抗体 抗CD63小鼠单抗（MEM-259） 抗Flotillin-2 小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司 抗Lamp-1小鼠单抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司
K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10%FBS-添加培养基） 用MagCapture™外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法，从K562 细胞培养上清（10% 去外泌体 FBS补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。
● 检测抗体 抗CD63小鼠单抗（MEM-259） 抗Flotillin-2小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司 抗Lamp-1小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司 健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较 实验数据 ①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量 通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。 ②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较 运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
对比AGPC法，使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA ◆外泌体蛋白质组学分析 <实验内容及结果> 分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含10% FBS（不含外泌体）的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化，用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。 比较通过MASS分析鉴定的前10个蛋白质 白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质 灰色柱：来自FBS的牛蛋白污染物 红 色：来自外囊泡的标记蛋白 样品：K562细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）
成对组合相关性比较
◆应用数据
Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度 Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质Cu2+离子被还原为Cu+。Cu+与BCA形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定562nm处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。 利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。 【实验内容及结果】 将通过MagCapture™外泌体提取试剂盒提取的25μL外泌体溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200μL。之后60℃孵育30分钟，检测560nm吸光度（图1）。结果表明，通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。
图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测
<BCA Assay 操作概要> 由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此BCA测定时不要稀释样品。 ① 将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg／mL和空白对照，分别每孔25μL加到96孔板中。 ② 分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔25μL加入96孔板。 ③ 把200μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂A盒试剂B混合液（A:B=50:1）加入放有样品的孔板中。 ④ 60℃孵育30分钟 ⑤ 室温条件下降低孔板温度 ⑥ 测定560nm的吸光度
◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验 【实验概要】 用PKH67（Sigma公司）标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡， Hela细胞导入确认 <外泌体PKH67标记> 1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体） 2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度 3. 将相当于5μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5mL管中。 *请配制合适的使用量 4. 将2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution* *请配制合适的使用量 5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中，混合后在室温中孵育5-10分钟。 6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000） （Thermo公司）。 7. 将100μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（最大添加量：100μL）。 *准备必需的支数。 8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中，24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。 *根据实验调节外泌体添加量
图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察 从16mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4mL培养上清液作为样品，通过PS亲和法提取外泌体。 ● 提取的外泌体蛋白质浓度：22.3ng/μL ● 粒子浓度：1.2×108 particles/mL 将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。 Opti-MEM：取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。
◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作 样品预处理：对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。 下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。
更换缓冲液（限制过滤）操作 用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。 1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20（100K）中。 2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中， 混匀。 3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下进行离心处理。 4. 减少上线的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。 5. 4℃下离心处理。 6. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。 7. 4℃下离心处理。 8. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 缓冲液。 9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。 10. 进行提取。
◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤
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