◆原理
聚集小体（Aggresome）是由一群不正常堆叠在一起的蛋白质所形成的包涵体（Inclusion Bodies）。聚集小体的出现往往也表明细胞正处于某种应激状态，比如高温、病毒感染、活性氧自由基攻击等。聚集体通过隔离毒性，聚集蛋白质，还可以通过自噬促进细胞代谢。提供细胞保护功能。
研究人员人文与人类疾病相关的某些细胞包涵体来自于聚集小体的反应，包括与阿尔茨海默氏病相关的细胞内外的聚集小体、与帕金森氏病的神经元相关的路易体、与酒精性肝病的干细胞相关的马洛里小体、与肌萎缩侧索硬化症（ALS）的星形胶质细胞相关透明包涵体。PROTEOSTAT®聚集小体检测试剂盒提供了一种快速、特异、定量的方法来识别一个真正的细胞环境相关的神经退行性疾病抑制剂。该固定的细胞检测不需要具备生理活性的蛋白突变体或基因工程的细胞株。PROTEOSTAT®染料已经在广泛的条件下验证，与小分子调节剂一起使用，适用于具有治疗价值的化学物的筛选。优化抗体共定位研究，确定聚集蛋白物质、自噬细胞和聚集小体的形成中涉及各种蛋白之间的相互作用。
◆试剂盒组成
| 试剂 | 包装 |
| ProteoStar™ Aggresome Detection Reagent | 10 μl |
| Hoechst 33342 Nuclear Stain | 50 μl |
| Proteasome Inhibitor (MG-132) | 120 nM |
| 10X Assay Buffer | 25 ml |
◆优点・特色
1、特点
● 可靠、简便、精确的检测细胞内的蛋白质聚集反应。
● 采取了细胞固定检测方法，该方法是抗体共定位研究的优选方法。
● 可用于流式细胞实验。
● 基于细胞的灵敏的药物反应分析方法。
● 不需分离目的的蛋白或稀释样品与常规缓冲液兼容
● 在荧光微孔板中即可进行简单、灵敏、均一地检测
● 可与其他检测手段联用，获得更精确的结果
● 可检测不同蛋白的聚集
● 可检测蛋白多肽聚集程度，可用于筛选蛋白
● 与传统蛋白聚集检测染料相比更灵敏，信号更明亮
● 聚集激活剂或抑制剂
● 在宽pH（4-10）和宽离子强度范围都可使用
2、优点
● 检测样品不需要具备生理活性的蛋白突变体或基因工程的细胞株。
● 能够识别在聚集小体形成时聚集的蛋白和与其相关联的蛋白的相互作用。
● 适用于具有治疗价值的化学物的筛选。
● 首次实现了聚集小体积累的简易定量分析。
● 有助于在细胞环境中检测神经退行性疾病相关的聚集抑制剂。
◆案例・应用
● 使用例 1：流式细胞术检测聚集小体
| 大动肝 | 
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| 用0.2% DMSO模拟培育Jurkat细胞或在37℃下用5µM的MG-132过夜培育。然后，用proteostat®染料孵育和固定细胞，不需清洗然后直接通过流式细胞仪，在FL3信道使用488nm的激光进行分析。在MG-132处理的细胞时，红色荧光信号增加了约3倍。上述的操作会影响蛋白质聚集小体的检测。 |
| 用0.2% DMSO模拟培育Jurkat细胞或在37℃下用5µM的MG-132过夜培育。用荧光素p62 Ab (1:500稀释原液)培育细胞。清洗细胞后，通过流式细胞仪在FL1信道使用488nm的激光进行分析。在MG132处理的细胞时，荧光素p62 Ab的抗体信号增加约2.5倍。 |
● 使用例 2：ProteoStat™ 染料与荧光染料的应用
用5μM MG-132培育带有HeLa细胞的聚集小体12小时后（右图），加入ProteoStat®聚集小体染料（红色）和用Hoechst33342复染，然后进行观察。未经培育的聚集小体（左图）。 | 
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预先用5μMMG-132培育带有HeLa细胞的聚集小体12小时后，用ProteoStat®聚集小体染料来染色观察（左上图绿色部分）；与AlexaFluor®647微管蛋白抗体（左下图红色部分）共定位；通过荧光显微镜观察的合成图像（右图）。 | 
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| 预先用5μMMG-132培育带有HeLa细胞的聚集小体12小时，用ProteoStat®聚集体小染料来染色观察（左上图），与荧光素p62的抗体（右上图）共定位，通过荧光显微镜观察的合成图像（下图）。 | 
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● 使用例 3
不同搅拌速率对蛋白聚集的影响使用本产品检测后，可知搅拌速度越快，蛋白聚集程度越大
● 使用例 4
蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集蓝色曲线为对照，没有搅拌；在搅拌速度在300rpm下， 绿色曲线与红色曲线分别表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情况。使用本产品检测后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。
● 使用例 5
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α-syn混合物形式聚集在被内化到M17神经母细胞瘤细胞系的细胞质膜。用α-syn单体处理M17细胞，声波处理α-SIGN PFFs或α-SYN混合物（M + F）。四天后，在固定M17细胞前，将其清洗3次，用 PROTEOSTAT®聚合染料（绿色）染色和用抗α-syn（红）和β连环蛋白（灰色）免疫染色。比例尺= 20µm。作者提到“Fibril生长和播种量α-synuclein蛋白介导的细胞凋亡中发挥重要作用。”此图来自A-L Mahul-Mellier, et al.; Cell Death & Differentiation (2015). (doi:10.1038/cdd.2015.79). |
● 使用例 6
在PROTEOSTAT®聚集小体检测试剂（A）和Hoechst 33342核染色（B）的激发和发射光谱。
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● 使用例 7
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| 由内质网应激的自噬细胞产生的聚集小体和聚集小体类的包涵体，epi-荧光显微成像图。未经处理的K562细胞（A）；加入5 mM MG-132溶液培育24小时（B）；加入50 mM CQ培育24小时（C）；加入100 nM毒胡萝卜素（D）。在温室下，用PROTEOSTAT® 染料(1:10,000稀释)来固定染色细胞30分钟。PROTEOSTAT® 的着色显示 聚集体 和 ALIS呈红色， DAPI 呈蓝色。（Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK） |
● 使用例 8 内质网应激相关的细胞自噬产生蛋白聚集小体进行流式细胞仪分析
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| 分别25，50，75mmCQ，100nM的毒胡萝卜素（TG）或5mM的MG-132处理K562细胞24小时。然后在温室下用PROTEOSTAT®染料（1：10,000稀释）固定并透化培育细胞30分钟。接着在BD LSR II的蓝色610/20nm的信道分析细胞（30,000）。Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK. |
● 使用例 9
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分别使用毒胡萝卜素（Tg，0.1微米），25，50和75微米氯喹（CQ）处理K562 细胞24小时，来诱导内质网应激和不完全自噬细胞。采用阳性对照，加入蛋白酶体抑制剂，镁 132 (5 µ M)培育 24小时。固定并透化沉淀的细胞。接着根据说明书的指示，在室温下用 300 µ l PROTEOSTAT® 聚集小体检测试剂盒 （Enzo Life Sciences）培育细胞30分钟，加入1 微克/毫升 DAPI （用来测定细胞周期）。S值聚集小体小倾向的因子（APF）相对增加，G1和G2m的S值是通过每次细胞处理后检测的结果和对照组相比而得出。S期和G1相比，ER 应激诱导剂、Tg和 50 µ M CQ的聚集小体数量呈上升趋势，同时显示蛋白酶体抑制剂，MG-132和50μMCQ下降的聚集小体数量在G2M S期比对照水平更低。Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK. |
