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贝克曼-干货 | 杂交捕获测序的自动化经验分享

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发表时间:2023-09-21 16:37作者:诺扬生物来源:贝克曼

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下一代测序(NGS)技术的发展,广泛应用于遗传性疾病和肿瘤突变检测。对于遗传性疾病和肿瘤突变检测,是通过对人类基因组的特定区域进行深度测序,加以生物信息学的分析,实现高灵敏度和高准确性检测。


目标区域捕获测序技术,是研究人类基因组特定区域的主要技术手段之一,根据已知基因组区域序列设计特定寡核苷酸探针,通过杂交将目标区域进行捕获、富集,再进行测序。然而捕获建库实验流程长,操作步骤繁琐,在手工操作的过程中总是会遇到各种各样的问题:




01

杂交实验第一步,对文库进行浓度测定,根据pooling规则计算好取样量,打印表格,准备pooling。文库浓度测定,如果使用单管测定浓度,文库需逐个加入到单管,而且单次测定的个数也有限,耗时、工作量大。



02

杂交文库pooling时,需要不断的调节移液器,从不同的孔内取样pooling成不同的杂交文库;此步骤繁琐且极易出错。



03

第二天的捕获实验,试剂需要提前准备、孵育,以在合适的时间使用孵育完成的试剂;试剂孵育不到位,会影响热清洗的效率,影响捕获效率。



04

捕获实验过程中,加液——加盖——混匀——离心——上磁力架——去盖——弃上清,这样的实验操作,需要至少10次以上;纯粹的重复操作,且人工在操作时,易发生液体飞溅引起污染。



05

不同实验员的实验结果,也可能有差异:文库浓度差异、捕获效率差异。这些差异产生可能是因为实验员经验差异、操作手法差异、或其他人为因素,不能得到有效控制。


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自动化捕获测序

针对复杂繁琐的杂交捕获实验流程,我们推出了Biomek 自动化杂交捕获建库工作站,帮助您实现自动化、标准化的杂交捕获流程。自动化工作站进行杂交捕获,可以减少手工操作时间,提高工作效率,同时保证结果的重复性和均一性。


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Biomek i7双臂自动化捕获建库工作站


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Biomek i7双臂自动化捕获建库工作站配置图示


工作站系统组成:

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SMP1:酶标仪,自动测定文库浓度

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ATC:自动PCR仪,文库变性、杂交,post-PCR

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温控孵育模块,分为固定孵育模块(Pelt)与震荡温控模块(SPelt),用于孵育热清洗试剂,温控洗涤


如上配置的自动化捕获建库工作站,能够完成从文库浓度测定至上机文库pooling的自动化流程,如下图。图中混合文库浓缩步骤,采用磁珠方法进行浓缩回收的流程,可以由工作站来自动化完成。如果采用真空抽干的方法浓缩混合文库,可以选配自动化氮吹仪来实现自动化流程。


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贝克曼库尔特生命科学从软件层面可以提供更加便利的自动化工作站使用体验:


1

Biomek Method Launcher (BML)

BML是一款独立的软件,在不影响自动化建库方法完整性的基础上,能够通过BML实时观察实验进度。同时BML还内置了DeckOptix Final Check软件,以减少因为实验耗材摆放错误引起的实验失败。


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2

Method Options Selector (MOS)

MOS允许选择样本数量,是否使用在线PCR仪,post-PCR循环数等,以最大限度地提高灵活性和适应性以及方法执行的简便性。


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关于自动化捕获建库,小贝归纳了8条自动化捕获建库过程中的常见问题解答:


1

文库浓度测定与杂交文库pooling

文库浓度测定,可直接使用酶标仪一次性测定96个文库的浓度,轻松便利。测定的浓度数据,会自行保存到本地。Biomek软件中设定了杂交文库的pooling规则,在获得文库浓度数据后,Biomek自动化捕获建库工作站自动进行杂交文库的pooling,代替人工完成繁琐的杂交文库pooling工作。


2

杂交文库的真空浓缩

真空浓缩这一步,可以选择实验室现有的真空浓缩仪进行浓缩,人工将浓缩好的文库放回自动化捕获建库工作站,以衔接下一步;或通过采用整合氮吹仪的方式实现,通过设置氮气的气体流速、温度,将pooling好的文库进行蒸干,完全在线进行,实现全程自动化。


3

杂交试剂、探针的加入

在不同的实验阶段需要适时加入不同的杂交试剂和探针,人工操作时需要拿着计时器计时,时间到了尽快加入试剂。在Biomek自动化捕获建库工作站上,可以将需要的试剂分装到放1.5mL离心管中,放到低温模块上。Biomek自动化捕获建库工作站会在合适时间自动加入所需试剂,无需人工值守。


4

杂交时间灵活

不管是快速杂交(1-4小时)或过夜杂交(12-16小时),都可以在Biomek自动化捕获建库工作站上配置的自动PCR仪中完成。同时,对于后续实验时间不好把握的情况,也能够完美解决。

例如:快速杂交1小时,杂交时间到了的时候我有会议需要参加,我又希望做捕获的时候我能看着,怎么办?

解决:Biomek软件中,在恰当的时间点设置暂停,让您的文库保存在自动化PCR仪中,会议结束后回来,点击确认按钮确认进行下一步操作,才会自动进行下一步骤的捕获操作。


5

清洗试剂准备、孵育

准备足量的试剂置于试剂槽中。Biomek软件按照自动化流程的设定,自动化分装常温清洗试剂、热清洗试剂。在合适的时间点,将热清洗试剂放到恒温孵育模块上进行热孵育,再也不用担心忘记孵育试剂或试剂孵育时间不足的问题。


6

post-PCR需要不同的扩增循环数

在一批捕获文库中,由于使用了不同探针,可能在post-PCR扩增时,需要使用不同的循环数。同样可以通过Biomek软件的设定,将不同循环数的文库挑出,放至到不同PCR板中,分开扩增。


7

最终文库保存

捕获文库的数量一般较少,一般会选择保存在1.5mL EP管中,后续使用较为方便。1.5mL离心管和96孔PCR板,在Biomek工作站上均可以使用,且不限制耗材品牌。


8

捕获效率、实验结果均一性

在调试自动化捕获程序时:

1

通过严格测试恒温孵育模块的加热效果和升温所需时间,保证热清洗试剂的孵育温度与时间足够;

2

保证各步骤弃废液干净,无残留;

3

试剂添加准确。保证了自动化捕获流程的文库捕获效率;且工作站进行操作,保证了操作稳定性,得到的实验结果均一性较好。


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