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海星生物:使用CRISPR基因敲除文库筛选进行靶点识别和药物发现

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发表时间:2024-05-30 10:05作者:诺扬生物来源:海星生物

研究背景

  • 胰腺导管腺癌(PDAC)是一种致命的癌症,预后差。
  • KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4等基因的突变在PDAC中较为常见。
  • MEK信号通路是RAS-RAF-MEK-ERK通路中的关键组成部分,在PDAC中起重要作用。
  • 单独使用MEK抑制剂在PDAC的临床试验中效果不佳。预测药物反应和发现新的药物靶点是癌症研究和精准医疗的重要目标。
  • CRISPR基因敲除筛选是一种强大的功能基因组学工具,可用于发现影响药物反应的基因。
  • DREBIC方法结合CRISPR筛选的存活分数和基线基因表达水平,用于模拟细胞对药物治疗的全球响应。

研究思路

1. 研究人员使用大规模体内和体外 CRISPR 基因敲除筛选技术,在胰腺导管腺癌细胞中寻找能够与 MEK 信号抑制剂协同提高细胞毒性的基因。

2. 在 MEK 信号通路被抑制时,多个基因的遗传缺失或药物抑制能与 MEK 抑制剂协同作用,增强其细胞毒性。

3. 研究人员开发了一种名为 DREBIC(通过体内 CRISPR 筛选评估药物反应)的方法,并利用独立实验的大规模实验数据验证了其效果。

4. CRISPR 筛选可以用来识别药物的遗传靶点,而 DREBIC 类似的方法则能够通过模拟整体药物反应来实现精准医疗。

技术路线

1.使用CRISPR基因编辑技术在胰腺癌PDX模型中进行大规模基因敲除筛选,以发现MEK抑制剂的协同靶点。

2.通过体内和体外筛选,发现多个基因敲除与MEK抑制剂协同增加细胞毒性的基因,如CENPE和RRM1,CRISPR文库筛选阴性筛选。

3.使用小分子抑制剂验证基因敲除与MEK抑制剂协同作用,发现CENPE和RRM1是MEK抑制剂的协同靶点。

4.利用长期活细胞成像技术,发现MEK抑制可导致CENPE敲除细胞在有丝分裂过程中发生细胞死亡,揭示了MEK信号与有丝分裂过程之间的相互依赖性。

5.开发了一种新的药物响应预测方法DREBIC,通过整合CRISPR筛选中的基因表达水平和基线基因表达水平,预测细胞对MEK抑制剂的响应。

6.分析验证了DREBIC方法在预测不同组织来源的癌细胞对MEK抑制剂响应方面的准确性和预测能力。

7.利用DREBIC方法分析了不同基因突变对MEK抑制剂响应的影响,发现DREBIC方法能够预测未知基因突变对MEK抑制剂响应的影响。
8.研究结果表明,CRISPR筛选可以用来发现药物的遗传靶点,而DREBIC类型的方法可以实现精准医疗,通过模拟整体药物响应和识别癌变突变对MEK抑制剂的药物特异性治疗脆弱性。

实验结论

1. 使用CRISPR基因编辑技术在胰腺癌PDX模型中进行大规模基因敲除筛选,以发现MEK抑制剂的协同靶点。


体内筛选:在注射后1周,动物随机接受对照(n = 3)或曲美替尼治疗(n = 3),为期4天。

体外筛选:   将培养的细胞每3天暴露于对照二甲基亚砜(DMSO)或20%抑制浓度(IC20)剂量的曲美替尼,持续4周。

2. 在所有肿瘤中持续降低的sgRNA靶向关键的有丝分裂细胞周期和着丝点功能,如CENPE,NUF2, MIS12和CENPI。

2.1 癌症基因组图谱(TCGA)分析显示,这两个基因的高表达与PDAC的不良预后显著相关。

注:RRM1编码核糖核苷酸还原酶的催化亚基。由于其在细胞周期和DNA合成中的关键作用。CENPE是一种着丝点相关蛋白,是染色体聚集和有丝分裂检查点信号转导的必需蛋白。

3. 利用CRISPR/Cas9系统对PDX366和mPanc96细胞中的CENPE和RRM1进行了基因靶向并去除,对照、MEK抑制剂(曲美替尼)、CENPE抑制剂(GSK923295)以及MEK抑制剂和CENPE抑制剂联合处理下,PDX366、mpanc96和BxPC3三种不同细胞系的相对活力/生长抑制水平得到了显示。


MTT细胞活力/生长抑制实验

4. 当CENPE和MEK都被抑制时,有丝分裂延迟略有减少,MEK和CENPE的抑制会导致有丝分裂期间显著的细胞死亡,表明MEK信号通路对于克服有丝分裂延迟期间的凋亡信号是必需的。

5. 评估体内药物协同作用:联合治疗阻断肿瘤的形成,最后,这也会导致肿瘤已经形成后肿瘤体积的显著缩小。

研究结果

本研究中,利用CRISPR筛选技术帮助识别出能够与 MEK 信号抑制剂协同提高胰腺导管腺癌细胞毒性的基因CENPE。

1. 构建了一个包含约4000个基因的sgRNA库,并将其转染到患者来源的胰腺导管腺癌细胞系PDX366中。
2. 将细胞系分为两组,一组在小鼠体内进行原位注射形成肿瘤,另一组在体外培养。在体内组,部分小鼠给予MEK抑制剂trametinib治疗。
3. 通过深度测序肿瘤DNA,分析不同sgRNA的丰度变化,从而评估每个基因在trametinib处理下的存活能力。
4. 通过对数据进行分析,研究人员发现了一些基因,其sgRNA的丰度在trametinib处理后显著降低,表明这些基因的敲除能增加细胞对MEK抑制剂的敏感性。   
5. 通过体外实验验证了CENPE和RRM1是MEK抑制剂的潜在协同靶点。   
6. 进一步研究了CENPE和MEK抑制剂协同作用的可能机制。


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