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海星生物:HEK293细胞培养工艺

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发表时间:2024-05-29 09:39作者:诺扬生物来源:海星生物
细胞的培养工艺主要有以下几种:

1. 贴壁培养(Adherent culture):这是最常见的细胞培养方式,使用含有血清的培养基,细胞贴附在容器表面生长。通常使用含有10% FBS的DMEM培养基在T-flasks中培养HEK-293T细胞。

2. 悬浮培养(Suspension culture):这是一种细胞不贴附在容器表面的培养方式,可以获得更高的细胞密度。

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3. 批次培养(Batch culture):这是指在一定时间内,细胞在封闭系统内连续培养,期间不更换培养基。

4. 半更换培养(Semi-batch culture):这是一种间歇式培养方式,在培养过程中部分更换培养基,以补充营养物质和去除代谢废物。为了进一步提高悬浮培养的细胞密度,可以考虑采用半更换培养基的方式。

5. 流加培养(Fed-batch culture):这是在批次培养的基础上,在培养过程中根据细胞对营养物质的消耗和需求,流加浓缩的营养物,从而进一步提高悬浮培养的细胞密度。

6. 灌流培养(perfusion culture):这是把细胞和培养基一起加入反应器,在细胞培养过程中,不断地将部分培养基取出,同时添加新的培养基,在这个过程中,绝大部分细胞保留在培养容器中。


HEK293细胞可以贴壁和悬浮形式生长。贴壁细胞以单层形式生长,而悬浮培养物以球体形式生长。贴壁培养型细胞细胞膜表面含有大量的可调节贴壁培养型细胞的活性,促进细胞生长增殖的黏附因子,这些黏附因子通过介导细胞与胞外基质(extracellular matrix, ECM)或细胞间接触激活不同的信号通路。将贴壁培养型细胞从ECM上分离,或者使其失去和其他细胞间的接触,会导致胞内凋亡信号通路被激活,这一过程引起的细胞凋亡被称为失巢凋亡。通过人为干预使贴壁培养型HEK293细胞在驯化过程中逐渐产生对失巢凋亡的颉颃,从而使其可以在无血清悬浮培养基中存活并生长。目前已有通过编码贴壁培养型细胞的基因,使其快速适应悬浮培养体系,但常见的是物理方法,是指贴壁细胞先进行悬浮驯化,再进行无血清驯化,最后进行生物反应器高密度驯化。

现有的悬浮细胞驯化的方法,是通过逐步降低血清含量,使HEK-293T细胞适应无血清培养基,然后在摇瓶中使用摇床使细胞适应悬浮培养。具体步骤如下:

(1) 初始采用100%含FBS的培养基,逐渐降低FBS含量,逐步增加无血清培养基(SFM)的比例,直到完全适应无血清条件。这个过程从0% SFM开始,逐渐增加到25%,50%,75%,87.5%,95%,直到100% SFM。
(2) 在每次更换培养基后,都至少进行两次细胞传代,以确保细胞能在新的培养条件下维持高活力。
(3) 在完全适应无血清条件后,可以添加1%的胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)和10%的Cell Boost 6来改善细胞活力。
(4) 在整个悬浮培养适应过程中,建议使用摇瓶在摇床上培养,以使细胞适应悬浮状态,同时需要监测了细胞的生长、活性和倍增时间等参数。

影响HEK293细胞在无血清悬浮培养条件下的细胞活率和密度的主要因素包括:
(1) 培养基组成:使用专用的无血清培养基,添加1%的Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)和10%的Cell Boost 6来提高细胞活力。这些添加剂对于维持细胞活率至关重要。
(2) 培养方式:逐步减少血清含量的方式使HEK293细胞慢慢适应无血清培养基。
(3) 培养容器和搅拌:使用摇瓶并在摇床上培养,这有利于细胞保持在悬浮状态并提高细胞密度。
(4) 营养物质浓度:监测培养基中葡萄糖的浓度变化,葡萄糖的快速消耗与细胞密度的增加相关,定期补糖有利于提高细胞活率。

因此可以通过优化培养基组成、培养条件、以及监测营养物质的浓度,可以有效地提高HEK293细胞在无血清悬浮培养条件下的活率和密度。


HyCyte® HEK293表达培养基呈是一款专为悬浮适应的HEK293衍生细胞而设计的无血清、无动物源成分、化学成分明确的培养基,适用于HEK293F、HEK293T、HEK293H、Expi293等复苏、传代、高密度流加培养以及瞬时转染表达,可实现重组蛋白、慢病毒、腺病毒的高水平表达,可用于相关产品的研发和生产过程。


参考文献

【1】Lomba A L O, Tirapelle M C, Biaggio R T, et al. Serum-free suspension adaptation of HEK-293T cells: basis for large-scale biopharmaceutical production[J]. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2021, 64: e21200817.
【2】王朋朋,黄书林,张云科,王展慧,吴文学.哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术研究进展[J].中国畜牧兽医,2021,48(03):839-845.


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