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愚公生物-限制性内切酶的前世今生

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发表时间:2023-11-17 09:12作者:诺扬生物来源:愚公生物

对于分子生物学和基因工程的从业者来说,限制性内切酶(Restriction Enzymes,简称限制酶或内切酶)是再熟悉不过的工具,在中学生物教科书中就有相当篇幅的描述。限制酶能够识别特定的DNA序列,并将DNA切开,被称为DNA的“分子剪刀”。有了限制酶,人类才能够开始对基因进行各种编辑操作。可以说,没有限制酶,就没有基因工程。今天,我们就走进第一代基因编辑工具——限制酶的前世今生。

  01   限制性内切酶的发现  

因发现并应用限制酶而获得1978年诺贝尔生理学或医学奖的三位科学家


20世纪60年代,科学家发现某些噬菌体(在细菌内寄生的病毒)侵染某一类特定细菌后,噬菌体在细胞内的增殖会受到“限制”。1962年开始,瑞士遗传学家Werner Arber课题组发表了一系列论文,提出在细菌中存在一类“限制-修饰”系统:有一种酶能够降解外来噬菌体的DNA,从而限制噬菌体在细菌内的繁殖;而同时细菌中还应该存在一种修饰酶,能够保护细菌本身的DNA不被破坏。1968年,在Arber的启示下,美国科学家Matthew Meselson和Robert Yuan首次从大肠杆菌菌株中分离获得了限制酶EcoKI和EcoBI,证实了Arber的猜想。

比Arber稍晚一些,美国生物学家Hamilton Smith也在噬菌体侵染流感嗜血杆菌的失败实验中发现了类似现象。在一次期刊研讨会上,Smith读到了发现EcoKI的论文,很快意识到流感嗜血杆菌中应当也存在同样的限制-修饰系统。1970年,Smith课题组从流感嗜血杆菌中分离纯化到了另一种限制酶HindII。

在Hamilton Smith分离到HindII时,他的同事Daniel Nathans(当时正在以色列做访问学者)已经被如何将病毒DNA切割成片段的问题困扰了一年多。Smith写信告诉Nathans发现了一种可以在特定位置切割DNA的酶。Nathans意识到这将是个非常重要的技术,立即回到美国与Smith展开合作。1971年,Nathans以最简单的动物致瘤病毒SV40为基础,用限制酶把SV40病毒DNA切割成11个特定的片段。1973年,Nathans又用另外两种新发现的限制性内切酶切割了SV40病毒基因组DNA,然后对三种限制性内切酶切割而成的DNA片段进行排列组合,得到了SV40的基因组物理图谱,这是人类首次用化学方法获得的基因组图谱。

限制性内切酶的发现和制备,使得人类可以开始对基因进行剪切、组合等编辑操作,标志着基因工程技术的诞生。因发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用,Werner Arber、Daniel Nathans和Hamilton Smith共同获得了1978年诺贝尔生理学或医学奖。


瑞典1989年发行的诺贝尔奖纪念邮票。票面为限制酶切割DNA分子示意图,左下方有三位获奖者的名字


02   限制性内切酶的商业化历程

限制酶的商业化历程


1974年,美国科学家Donald Comb辞去了哈佛医学院生物化学系副教授的职位,在自家车库里创办了New England Biolabs(NEB)公司。1975年NEB推出的首批产品就包含18个限制酶,第一年就实现了20万美元的销售收入,在那个年代是一笔非常丰厚的回报。此后,NEB始终秉承“By scientist, For scientist”(由科学家创建,为科学家服务)的精神,为分子生物学工作者提供各种优质的工具酶,仅限制酶产品就有270种,成为该领域的领军企业。

NEB创始人Donald Comb (1927-2020)


在NEB发展历程中还有一位关键人物Richard Roberts。1972年,他在聆听了Daniel Nathans关于限制酶应用的报告后,立即决定转投这个领域。在1974年NEB创立之初,Roberts就担任顾问兼科学咨询委员会主席。他率先收集了各种已发现的限制酶信息,建立了第一个限制酶数据库——REBASE,并由NEB维护至今。1992年,Roberts全职加入NEB担任首席科学家直至今日。1993年,Richard Roberts因为发现断裂基因(即基因由外显子和内含子组成),而与Phillip Sharp共同获得诺贝尔生理或医学奖。


NEB首个限制酶产品目录


与此同时,冷战铁幕另一边的苏联也在分子生物学领域进行着积极的探索。早在1962年,苏联政府就决定建立5个酶工厂,其中3个位于俄罗斯,1个位于哈萨克斯坦,1个位于立陶宛。立陶宛工厂于1970年建成,1971年投产,厂区内的生物技术研究所也开始运营。1975年,苏联应用酶学研究所在立陶宛成立,Arvydas Janulaitis在此研发出苏联的第一个限制酶,并与NEB一起不断丰富着REBASE。


苏联时期的立陶宛酶工厂及生物技术研究所


1990年,立陶宛等波罗的海三国宣布脱离苏联独立,应用酶学研究所也随之拆分,留在立陶宛的Arvydas Janulaitis等人成立了MBI Fermentas,继续从事分子生物学工具酶的商业化开发,陆续推出了188种限制酶产品,成为世界第二大限制酶供应商。2010年,Fermentas被ThermoFisher Scientific整体收购。


2003年,理查德·罗伯茨(左起第5)带领NEB团队(左起第4-6)访问Fermentas时合影,最右为Arvydas Janulaitis

而在太平洋西侧,成立于1925年的宝酒造株式会社(Takara Shuzo)也不满足于在食品发酵行业的成就,决定进军生物酶领域。1979年,Takara推出了第一款限制酶产品。2002年,Takara的生命科学事业部独立为Takara Bio,现拥有90种限制酶产品,成为世界第三大限制酶供应商。除此之外,还有Roche、Promega、Toyobo等知名生物技术企业也曾自行开发了一些限制酶产品,但均已逐步退出市场。


目前已在各种微生物中发现了4000多种限制酶,其中约400种形成了商业化产品。早期的限制酶产品反应时间较长,往往需要过夜;而且不同的酶在不同的缓冲液中活性差异很大,如果要使用两个酶或多个酶切割同一个DNA分子,用一个酶切完之后,需要换用不同的缓冲液再加入第二个酶,使用起来非常麻烦。2006年,Fermentas率先尝试通用缓冲液和快切,推出了FastDigest系列产品,这系列产品能够在通用的FastDigest缓冲液中,仅需5-15分钟即可完成酶切反应,大大方便了用户。然而,第一代FastDigest系列仅有19个产品,选择余地太小,未能产生太大反响。2011年,收购了Fermentas的ThermoFisher重磅推出176种FastDigest系列快切酶,轰动了整个领域。随后,Takara在2012年也推出了QuickCut系列快切酶,不过仅有37种产品。2013年,“老大”NEB终于也推出了Time-Saver系列快切酶,现有超过180种产品。限制酶全面进入快速时代。


03

限制性内切酶的国产化


在中国,此前一直使用的全部都是进口限制酶,价格高,且供应不稳定。在大多数分子生物学常用酶都出现国产替代的时候,限制酶的国产化迟迟未能实现,隐隐成为横亘在我国生物技术发展浪潮中的一座大山。2015年,愚公团队启动了“王屋计划”,立志要搬掉这座大山,并于2016年推出了第一批国产快切酶产品。

时至今日,愚公生物(含旗下百时美生物)已推出63种限制酶产品,其中包含56种LightNing系列快切酶,覆盖了90%以上的限制酶应用场景,成为国内品种最多、产能最大的限制酶生产商,2022年国内市场占有率达到6%。未来愚公生物将继续坚持“创造酶好生活(Best Enzyme for Better Life)”的愿景,不断守正创新,为中国生物医学行业提供更多优质、经济、使用方便的工具酶产品,助推中国生物医药产业发展。


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