海星：如何使用聚乙二醇获得高质量纯化质粒

众所周知大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。但是此类方法也存在了一些例如使用化学物质诱导质粒突变的弊端，所以新的纯化方式的摸索必不可少。

其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法。首先我们了解一下什么是聚乙二醇(PEG)，聚乙二醇是一种高分子聚合物，化学式是HO(CH2CH2O)nH，无刺激性，味微苦，具有良好的水溶性，并与许多有机物组分有良好的相溶性。

PEG为一种非离子多聚物，多离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂。基于多聚物的沉淀作用主要依赖于多聚物的浓度和被沉淀物的分子量大小，Laurent等(1967)提出PEG的沉淀机理主要是通过空间位置排斥，使液体中的微粒(包括生物大分子、病毒和细菌等)被迫集聚在—起而引起沉淀的发生。PEG最早应用于提纯免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些细菌病毒，后来逐渐应用于核酸和酶的分离纯化，特别是用PEG分离质粒DNA，已相当普遍。

那么如何利用PEG进行质粒纯化呢？

下面介绍一下PEG纯化质粒的一般操作步骤：

1   向质粒溶液中加入等体积的用无菌的1.6M NaCl配置的13% w/v PEG 8000；

2   将试管内的物质涡旋充分混匀，然后-20°C孵育1 h至过夜

3   最高转速 4°C离心30 min；

4   轻柔吸取去上清，收集沉淀；

5   用500 μl 70% 乙醇冲洗颗粒，并短暂涡旋；

6   最高转速 25°C离心5 min，去除70% 乙醇；

7   再次离心去除酒精，干燥沉淀后溶解。

该操作的优点在于：操作条件温和，不易引起生物大分子的变性。同时具有极高的沉淀效能，少量的PEG可以沉淀相当多的生物大分子。