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蛋白MARKER知多少？
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Issuing time:2021-12-13 11:07Author:诺扬生物Source:雅酶 做WB的小伙伴都会用到蛋白Marker。关于蛋白Marker，小编经常接到技术咨询电话如何选择蛋白Marker，蛋白Marker条带不准，Marker条带消失、弥散，Marker条带能不能曝光出来……等问题。今天小编就带大家从以下几个方面来详细了解一下蛋白Marker。
蛋白Marker：即蛋白分子量标准，是一些已知分子量的蛋白质的混合物，像“尺子”一样用来指示蛋白质条带的大小。 目前最常用的蛋白Marker分为非预染蛋白Marker、预染蛋白Marker。 非预染蛋白Marker 是几种已知分子量并纯化好的蛋白质预混液。非预染Marker在电泳过程中看不到，电泳结束后经过蛋白染色后才能起指示作用，无法在实验过程中起预示作用。但是由于蛋白没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以最准确。 预染蛋白Marker 是纯化好的几种蛋白，通过与染料共价耦联后混合在一起，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到的一种蛋白Marker。 预染蛋白Marker在电泳过程可以起到预示作用，当观察目标蛋白大小位置进入最佳分辨区时，停止电泳，以得到最佳分辨效果。转膜过程可以监测转膜效率，同时可以在膜上标记蛋白分子量。 但是蛋白分子标记了染料后，由于染料标记效率存在一定的波动，所以各个批次间蛋白 Marker大小可能会存在一定的偏移，也就是预染蛋白Marker条带代表的是相对大小，而不是绝对大小。 预染蛋白Marker，又分单色预染Marker、双色预染Marker，多色预染Marker。如图：
单色预染蛋白Marker通常会加深某些条带的粗细，方便我们快速记忆和区分各个条带的大小。而彩色蛋白Marker则用不同的颜色，更加方便记忆区分。 除了上面介绍的，市面上还有一些其他类型的蛋白Marker：如显影蛋白Marker等。 显影蛋白Marker，蛋白条带中含有lgG结合位点，lgG结合位点会结合用于检测靶蛋白的一抗或二抗，使得蛋白Marker在印迹膜上可与目的条带一同呈现。 首先明确自己实验目的，如果只需要电泳后观察蛋白条带大小，可以用非预染蛋白Marker，毕竟价格便宜，且条带大小准确。如果做WB实验，可以选择预染蛋白Marker，这样可以实时观察到电泳、转膜情况。 预染蛋白Marker的选择，我们主要可以从以下几个方面考虑。 分子量范围： 蛋白Marker又分为高分子量、低分子量、宽分子量几类。检测大分子量蛋白经常使用到高分子量范围Marker，检测小蛋白甚至是一些多肽常会用到小分子量范围Marker。如果从整个实验室考虑，选宽分子量、条带分布比较均匀的Marker，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断。
条带准确性： 可以用非预染蛋白Marker作为参考、校准。
稳定性： 偶联的染料是否容易脱落，使条带颜色变浅，Marker是否容易降解。
与膜的亲和性： 转到膜上因为要多次洗膜，长时间孵育，所以Marker蛋白与膜的亲和性也十分 重要。
常见问题： 预染蛋白Marker，染料的标记反应和蛋白质的其它标记反应一样，其实际标记效率由于各种各样的因素而波动于一个合理的区间，不是一个确定的常数。在预染蛋白Marker的生产过程中，染料标记效率的波动将直接影响到最终标记产物的分子量大小。因此厂商都有一套优化的条件来实现相对稳定的染料标记效率。即使如此，标记效率的稳定性仍然不可能达到一个稳定的常数，仅能将其控制在一个比较小的波动范围。其结果是，染料标记的蛋白质产物的分子量在不同批次间会存在一定的波动。这就是我们俗称的分子量准不准的问题。由上述原理可知，没有哪家公司的预染蛋白Marker具有绝对的准确性。正如Thermo在其产品说明书中明确写道，预染蛋白Marker仅用作为蛋白质分子量的近似参考，不同批次产品间具有不大于5%的批间差异。 不同的蛋白质（不考虑修饰） ，即使分子量相同，也有可能（比例较小）由于氨基酸组成的不同等因素，而表现出泳动迁移率的差异。实践中，这种看起来似乎不符合电泳原理情况常常会出现，相信做实验比较多的小伙伴可能也曾遇到过。 同一蛋白Marker产品的谱型在不同体系的电泳中，也会出现不同的泳动行为。例如下图。
此外，相比于预制的梯度凝胶，在自制的固定浓度凝胶中，预染蛋白质分子量标准的条带会看起来显得略粗一些，而不如前者锐利。当条带较粗的时候，我们的实践经验显示，分子量的参考一般应以条带的上半部为准。 有些小伙伴的WB结果参照蛋白Marker，与预期大小不符，第一反应就是Marker不准。那么除了我们上面分析的预染蛋白Marker本身的准确性的问题，还有没有其他原因呢？ SDS-PAGE凝胶电泳按照分子量大小将蛋白分离，是蛋白在充分变性、还原条件下，使蛋白分子带上均匀密度负电荷，蛋白分子的形状是短轴一样的链状结构（单条肽链）来实现的。如果蛋白样品未充分变性、还原，其形状和电荷等因素会影响迁移率从而导致分子量与预期不符合。下图（1为变性、还原BSA（66KD）；2为变性、非还原BSA）。
由于基因表达的差异性，同种蛋白在不同来源样品中分子量可能略有差异。下图：来源CST（使用 GAPDH (D4C6R) Mouse mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。）
另外蛋白样本出现部分降解也可能会出现条带变小。由于蛋白序列的差异，降解的原因的不同，所以即使同一管样品，不同的蛋白可能降解程度不同。 除此之外，最近有客户做Ip实验遇到重链、轻链问题。反馈说跑出来的轻链条带位置，在雅酶Marker的25kd以下，认为雅酶Marker条带不准。客户普遍认为轻链是25kd，实际上轻链在22-23kd范围，下图（merck官网）。
大条带消失： Marker条带跑不出或者大条带消失原因一种是Marker本身降解，一种是电泳过程中降解。如果本身降解，电泳一开始应该就是模糊或者条带缺失的。如果是电泳过程中降解，是刚开始有，跑着跑着大条带消失。电泳过程降解，多是因为外槽电泳液加的非常满，和内槽液直接连通，导致短路，或者电极老化短路导致。 小条带弥散或者消失： 可能是电泳液中不含SDS或者SDS含量低于正常用量。
蛋白Marker每一个条带是单一纯化的蛋白，相对于目的蛋白其在膜上含量很高，所以如果抗体浓度以及抗体孵育的时间不合适，容易发生Marker蛋白和抗体非特异性结合，从而爆出条带。可以降低抗体浓度或者减少孵育时间，以及减少Marker上样量来优化。
雅酶多色预染蛋白分子量标准
注：WJ106 系列适用于近红外荧光成像系统。 g 高准确性 —— 蛋白条带分子量相较于同级别其它高端品牌产品更准确； g 分布合理 —— 蛋白条带分布更合理； g 低杂交反应 —— 条带蛋白去除蛋白质标签，最大程度降低抗体杂交反应； g 高性价比 —— 与其它同级别产品相比，性价比极高。 1. SUN, Xiaoting, et al. Inflammatory cell-derived CXCL3 promotes pancreatic cancer metastasis through a novel myofibroblast-hijacked cancer escape mechanism. Gut, 2021.（IF 23.059）good 2. Yan, B., Jiao, X., Zhu, H., Wang, Q., Huang, J., Zhao, J., ... & Zhang, H. (2020). Chemical interactions involved in microwave heat-induced surimi gel fortified with fish oil and its formation mechanism. Food Hydrocolloids, 105, 105779. (IF 9.147)good 3. PENG, Mengyao, et al. Effect of roasting on the antioxidant activity, phenolic composition, and nutritional quality of pumpkin (Cucurbita pepo L.) seeds. Frontiers in Nutrition, 2021, 8.(IF 6.576)good 4. Zhao, S., Shi, D., Su, C., Jiang, W., Zhang, C., Liang, T., & Hou, G. (2020). IL-27Rα: A Novel Molecular Imaging Marker for Allograft Rejection. International Journal of Molecular Sciences, 21(4), 1315. (IF 4.556)good 5. HUANG, Xiaoyu, et al. Nitric Oxide-Sensitized Mitoxantrone Chemotherapy Integrated with Photothermal Therapy against Multidrug Resistant Tumor. Materials Chemistry Frontiers, 2021.(IF 6.482)good 6. WANG, Meng, et al. Lack of Mof reduces acute liver injury by enhancing transcriptional activation of Igf1. Journal of Cellular Physiology, 2021.（IF 6.384）good 7. Yang, L., Sun, X., Ye, Y., Lu, Y., Zuo, J., Liu, W., ... & Zhu, S. (2019). p38α mitogen-activated protein kinase is a druggable target in pancreatic adenocarcinoma. Frontiers in Oncology, 9, 1294. （IF 6.244）good 8. Zhao, S., Shi, D., Su, C., Jiang, W., Zhang, C., Liang, T., & Hou, G. (2020). IL-27Rα: A Novel Molecular Imaging Marker for Allograft Rejection. International Journal of Molecular Sciences, 21(4), 1315.（IF 5.923）good 9. Cai, Y., Li, X., Pan, Z., Zhu, Y., Tuo, J., Meng, Q., ... & Pan, Y. (2020). Anthocyanin ameliorates hypoxia and ischemia induced inflammation and apoptosis by increasing autophagic flux in SH-SY5Y cells. European Journal of Pharmacology, 883, 173360.（IF 4.432）good 10. ZHONG, Yucheng, et al. Design, synthesis and biological evaluations of diverse Michael acceptor-based phenazine hybrid molecules as TrxR1 inhibitors. Bioorganic Chemistry, 2021, 109: 104736.（IF 4.411）good 11. XIE, Yang, et al. Dexmedetomidine attenuates acute kidney injury in children undergoing congenital heart surgery with cardiopulmonary bypass by inhibiting the TLR3/NF-κB signaling pathway. American Journal of Translational Research, 2021, 13.4: 2763.（IF 4.060） 12. REN, Hua Nan, et al. Proteomic analysis of hydrolytic proteases in excretory/secretory proteins from Trichinella spiralis intestinal infective larvae using zymography combined with shotgun LC-MS/MS approach. Acta Tropica, 2021, 216: 105825.（IF 3.112）good 13. LI, Wanhong, et al. Dietary supplementation of grape seed tannin extract stimulated testis development, changed fatty acid profiles and increased testis antioxidant capacity in pre-puberty hu lambs. Theriogenology, 2021.（IF 2.740）good 14. WANG, Jun-Ling, et al. Nogo-A-Δ20/EphA4 interaction antagonizes apoptosis of neural stem cells by integrating p38 and JNK MAPK signaling. Journal of Molecular Histology, 2021, 52.3: 521-537.（IF 2.611） 本期福利
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