Cell Death Detection Kit, 4AF555 TUNEL Assay,货号-规格:FXP144-050-50 tests
试剂盒组分:
A.TUNEL Equilibration Buffer | 5 mL |
B. TUNEL Reaction Buffer | 5 × 0.5 mL |
C. TdT Enzyme | 50 μL |
注意:
A 和 B 中含有有毒成分使用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤后,请立即有大量水冲洗,废液请按有毒物质处理。
描述:
细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段,本试剂盒采用 TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3´-OH 末端催化掺入 4AF555-dUTP。
4AF555-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪检测。适用于组织样本(石蜡切片,冰冻切片)或细胞。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞,而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。
TUNEL 实验中,TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的 3’羟基末端。抗原标记的 dUTP(如地高辛-dUTP、生物素-dUTP)可以通过孵育二抗(如抗地高辛抗体或链霉亲和素),然后进行荧光或比色法检测。而最佳的选择是荧光染料标记的 dUTP,因为它可以直接进行原位检测,是一种更快速、直接的检测手段。
实验步骤:
(一)实验前准备
1) PBS 缓冲液(pH7.4)
2) 4%多聚甲醛(in PBS)
3) 牛血清白蛋白(BSA) 或 正常的羊、牛血清
4) 70%乙醇(自选)
5) 脱蜡溶剂(石蜡切片样本)
6) 蛋白酶 K(石蜡切片样本)
(二)样本准备
细胞或新鲜冰冻组织切片
a. 可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液)
b. PBS 清洗细胞或组织两次
c. 细胞固定:加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液,4℃放置 30min(新鲜冰冻切片不需要此步操作)
d. PBS 清洗细胞两次
e. 通透细胞:加入冰上预冷的 70%乙醇,在-20℃ 孵育 4 小时。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者,细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置30min。
f. PBS 清洗细胞两次
石蜡组织切片
a. 可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液)。
b. 按照标准方法进行切片脱蜡和水化处理。
c. PBS 清洗细胞两次。
d. 用 PBS 稀释的终浓度为 20μg/ml 蛋白酶 K 溶液 100μl 透化组织,37℃放置 30min(蛋白酶K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。
e. PBS 清洗细胞两次,每次 5min。
(三)TUNEL 反应
1) 每个样本加入 100uL TUNEL 平衡缓冲液,孵育 5min。
2) 预先配制 TUNEL 反应混合液:每个样本需要已加入 1uL TdT 酶的 50uL TUNEL 反应缓冲液。
3) 弃去平衡缓冲液,每个样本加入 50uL TUNEL 反应混合液。
a) 贴壁细胞或组织样本,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。
b) 悬浮细胞,可加入微孔板中,采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15min 温和的震荡反应管,使之充分反应。
4) 37℃避光孵育 60min,组织样本需要 2h。
5) 300g 离心,去上清,使用适量配制于 PBS 中的 0.1%。Triton X-100,其中含 5 mg/ml BSA的缓冲液清洗样本 3 次。
6) 根据需要进行复染。用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析。4AF555 与 Texas Red 染料的光谱类似,激发波长、发射波长分别为 555nm,565nm。(凋亡细胞应被标记上明亮的红色荧光,没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。