动物细胞无血清培养基

动物细胞无血清培养基的分类

1.经典的无血清培养基   

由各种可替代血清功能的生物材料配制，如牛血清白蛋白（BSA）、转铁蛋白、胰岛素及水解动植物蛋白胨等，此类培养基化学成分不明确，蛋白含量较高，不利于下游产物的分离纯化，且存在生物药物安全隐患。                                                                                  

2.无动物源组分培养基   

采用基因工程和重组蛋白或植物蛋白水解物取代动物源性蛋白衍生物，为生产重组药物打下了良好的基础，且降低了生产成本，在生物医药研发和生产领域广泛使用，是目前市面上销售的主要产品。                                                                                        

3.无动物蛋白培养基   

添加植物蛋白水解片段或合成的多肽片段，可消除血清源污染，目标蛋白的分离纯化更为容易，目标产物质量较稳定，原料成本下降，但此类培养基仅适用于少数细胞株，具有一定的应用局限性。                                                                                          

4.化学组分限定培养基

该类培养基化学组分确定，保证了培养基批次间的一致性，其中所添加的少量动物来源蛋白水解物都是化学成分明确的组分。该类培养基性质确定，增加了细胞代谢与表达的研究可靠性与一致性，属于个性化培养基，是培养基发展的主要方向。                                         

动物细胞无血清培养基的组成

    无血清培养基是在基础培养基的基础上，添加适合于细胞生长增殖的补充因子，以替代传统培养基中的血清成分，而针对不同的细胞株，基础培养基中所添加的补充因子的种类与浓度各不相同。                                                                                                

1.基础培养基

从1887年历史上最早的培养基诞生至今，细胞培养基已经历了近百年的发展。早期采用的细胞培养基主要来源于动物组织提取液或体液，如血清、淋巴液、胚胎浸出液等。但细胞在体外环境下要维持较长时间需要更多的营养成分及相应的缓冲系统，MEM培养基的问世有效缓解了这一问题。它含有细胞生长所需的氨基酸、葡萄糖、维生素及无机盐类，可使细胞或组织在体外维持更长的时间。此后，有学者在MEM培养基的基础上，研发出更适宜于细胞体外增殖的DMEM培养基。目前，合成培养基发展至今已有几十种，常用的主要有MEM、DMEM、199、RPMI1640等。                                                             

2.主要补充因子

    补充因子是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称, 主要包括激素、生长因子、结合蛋白、贴壁因子、维生素、微量元素等。                                                     

3.激素和生长因子

无血清培养基中常添加的激素有胰岛素、生长激素、胰高血糖素等。其中，胰岛素是促进细胞生长的关键成分，几乎是所有细胞在无血清培养中必需的。在细胞无血清培养过程中，胰岛素的添加浓度一般为0.1~10ug/ml，有研究表明在输卵管流体无血清培养基中添加适量胰岛素可促进胚胎的发育与胚胎质量。生长因子是体外细胞培养所必需的补充因子，可促进细胞的有丝分裂，在基础培养基中，生长因子都是通过牛血清引入的，主要包括神经生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子以及各种组织生长因子。               

4.蛋白类

无血清培养基中的蛋白类物质主要是牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）和转铁蛋白。牛血清白蛋白的添加量较大，可与激素、生长因子、维生素、金属离子稳定结合并调节其活性, 此外还可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。转铁蛋白是无血清培养基中必须添加的物质，具有生长因子的性质，主要从动物血清中提取，但成本较高且容易受外来致病菌影响。目前有学者运用基因重组技术在动植物及微生物表达系统中表达重组转铁蛋白，其分离纯化度可达95%以上，且活性与天然转铁蛋白相似，已开始应用于商业化生产。在无血清培养基中，当转铁蛋白含量达到5µg/ml时，亦可有效促进胰岛素的作用。                                                                                                              

5.促贴壁因子

绝大多数动物细胞在体外培养时需要贴附于适宜的基底上，因此，在动物细胞无血清培养过程中需要添加促贴壁和扩展因子，主要是细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的分化，如成纤维细胞、粒细胞、肾上皮细胞等。此外，这些因子还是重要的分裂素并维持正常细胞功能分化，对许多细胞的增殖和分化起着重要的作用。                                                                                                    

6.微量元素和维生素

在动物细胞无血清培养基中，最常添加的微量元素是亚硒酸钠，主要作用是消除氧化物和氧自由基对细胞的损伤。另外，在无血清培养基中添加Zn2+会加快细胞的增殖。维生素作为辅酶或辅助因子参与胞内反应，对于细胞代谢至关重要。维生素C和维生素E具有抗氧化作用，维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢，但也有研究发现有些微量元素却对细胞有毒害作用，如对rCHO细胞无血清适应及悬浮培养的研究中发现，当在无血清培养基中添加TL混合物（微量元素、氢化可的松、混合脂类与短多肽混合物）时，rCHO细胞形态变得不规则，光泽较差，而且结团较为严重。                                                 

7.抗剪切保护剂

细胞进行悬浮培养时会受到搅拌等引起的剪切力作用。在血清培养基中，血清可起保护作用，减少细胞受到的剪切力。而在无血清培养基中，常用普郎尼克F-68（Pluronic F68，P-F68）来防止细胞损伤。P-F68是一种用于细胞培养的非离子型表面活性剂，控制细胞悬液中的剪切力，在冻融、转移和搅拌过程中保护细胞免遭损伤。                                         

动物细胞无血清培养基的应用

动物细胞无血清培养作为一项重要的现代生物技术,已广泛应用于细胞生物学、药理学、临床医学及生物制品制造等领域。现阶段动物细胞无血清培养基的应用主要表现在以下几个方面：                                                                                                              

1.生物制品生产研究

由于无血清培养基化学成分较明确，蛋白含量低，动物来源成分较少，有利于下游目标产物的分离纯化，已广泛应用于疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品生产。随着无血清培养基的优化与改进，国内外的很多生产厂家都在致力于如何将无血清培养基与生物反应器技术更好的结合应用，使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养，以期提高产品质量，降低生产成本。如利用无血清培养基培养Vero细胞生产狂犬疫苗，不但有效提高了活细胞密度，且其最大病毒滴度远大于含血清培养的滴度。Gerdil C 等采用Vero细胞无血清培养生产流感疫苗，其细胞生长量和抗体产量较有血清时高，生产周期较短，可有效预防流感疫病的爆发。                                       

2.临床医学的研究

如在人表皮细胞的培养中，用无血清培养基比含血清培养基更有利于表皮细胞生长增殖，即成纤维细胞生长晚于表皮细胞, 在成纤维细胞尚未迅速增殖之前，表皮细胞集落已基本连接成片。因此，可应用于临床大面积烧伤治疗中。                                               

3.干细胞和免疫细胞的研究

利用无血清培养基SYL-SF对间充质干细胞体外培养较含血清培养基细胞增殖能力强，可维持MSCs特异性表面标志及分化潜能，且细胞凋亡率显著下降；无血清培养基在体外对人脐带来源间充质干细胞免疫调节活性的影响研究发现，无血清培养基培养的人脐带来源间充质干细胞可抑制CD4+T细胞的增殖及凋亡，分泌高水平的PGE2及高表达IDO1、

COX2、IL-1β及IL-6等基因水平。                                                                               4.特定细胞系的建立及筛选

通过对无血清培养基中的某些成分的取舍， 可抑制原组织培养物中非目的细胞的过度生长，达到选择目的细胞的目的。用无血清悬浮法培养MCF-7细胞系，可形成能够连续传代的细胞球，并从中筛选肿瘤干细胞相关亚群；袁鲁等利用无血清培养基悬浮培养建立的CHO-K1-SFS细胞系能较好地表达外源基因；利用无血清培养基从原发胶质母细胞瘤组织中分离培养胶质瘤干细胞。                                                                                     

展望

一直以来，人们通过经济与技术手段减少或消除细胞培养基中血清成分的影响。经典的无血清培养基是通过添加动物来源的胰岛素、转铁蛋白、白蛋白及其他蛋白因子为基底配方。近年来，生物学家们不断通过体内诊断、细胞与基因诊断及组织工程技术的临床实验不断进行无血清培养基的研发与改良，旨在消除细胞培养基系统中动物来源组分，并逐步应用于生物制品生产及研究。但在动物细胞大规模培养过程中，无血清培养基的应用也存在一些弊端，如细胞在无血清培养基中易受某些机械和化学因素的影响，成本较高，对细胞株的适用谱较窄，抗原稳定性较差等。因此，如何研制出能解决生产实际问题的个性化培养基和提高培养基优化技术是国内外培养基发展的主要方向。