动物细胞培养指南（四）

之前给大家介绍了细胞的复苏、传代培养、培养试剂相关，

本期给大家带来的是细胞培养不可缺少的另一个重要操作—细胞的低温储存！

低温储存

1、综述

随着细胞被冷冻至冰点以下，悬液中冰晶和溶质的浓度有所增加。如果冷却过程中，胞内水分可以渗出细胞，则可以减少胞内冰晶。通常1℃/min的降温速度可以促进此过程。但是，水分的丧失会导致细胞收缩，当这种收缩达到一定程度，又会导致细胞活性的剧烈下降。冷冻保护剂，如甘油或者二甲基亚砜（DMSO），可以缓解这种效应。细胞冻存的标准程序是在含有冷冻保护剂的培养基中，将细胞缓慢冷冻至–70℃，然后将冻存管转移到液氮中以保持低于–130℃的环境。

2、冻存培养基

5%-10%的甘油和DMSO是最常见的冻存保护剂。虽然DMSO对细胞有毒性，但是与甘油相比，其渗入细胞的速度更快，而且冻存重复性更好（而且细胞复苏效率更好）。但是，DMSO一方面会导致某些细胞（如HL-60早幼粒细胞）分化，另一方面对某些细胞（如HBE4-E6/E7肺上皮细胞）的毒性也过大。对于这些细胞，则应使用甘油。甘油可以通过高压蒸汽灭菌，而DMSO只能通过过滤除菌。DMSO或者甘油至少应达到试剂级（或者更高级别，如细胞培养级），并且分装，避光保存。

3、冻存管

冻存管材质分为两种：玻璃或者塑料。玻璃管更难操作，但更适合珍贵细胞的长期保存，而且一旦适当密封，其安全性也更高。

4、程序降温盒

有很多方法可以实现1℃/min的降温速度。电脑控制的可编程电子降温系统是最好的方式，可以精确保持降温速度。但这种设备价格较高，仅当对冻存非常敏感的细胞时才有必要使用。

比较经济的方式是将冻存管放置于冻存盒中，在低于–70℃的冰箱中冻存24小时。已有一些商业化冻存盒产品能够非常接近1℃/min的理想降温速度。或者可以将冻存管放置于壁厚大约15mm的1L容积的聚苯乙烯盒子中，并填充入纸、棉绒或者泡沫起到隔热的作用。

5、液氮罐冻存

长期保藏所需要的超低温（低于 -130℃）环境，可以使用低温冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中。液氮储存分为两种方式：将冻存管完全浸入液氮中或者悬于液氮液面以上的蒸气中。液体体系需要更多的液氮，后期维护简单，但是液氮有可能进入密封不严的冻存管中，并在细胞复苏时发生冻存管爆炸。

因此，强烈建议保存在液氮蒸气中。液氮蒸气会在罐内产生一个垂直的温度梯度。液氮底层为-196℃，而上层温度会受到液氮余量和液氮罐敞开时长的影响。为保证储存安全，请确保罐中液氮充足，以使上层温度低于-130℃。所有的储存系统都应配备温度报警装置。

6 、冻存程序

以下程序适用于大多数细胞，如果必要，可以适当调整。冻存培养基的配方请参考其细胞说明书。收获时，细胞应处于指数生长期。

1）冻存前先检测细胞是否受到细菌、真菌、支原体和病毒的污染。通常冻存后10-14天才能得到污染检测结果，如果确定有污染，应将该细胞销毁。

2）冻存培养基由完全培养基和5%DMSO组成。由于DMSO的溶解会放热，所以不能向细胞悬液中直接加入未稀释的DMSO。

3）以温和速度（125g×10 min）离心收集细胞，并以1×106~5×106活细胞/ml的密度重悬细胞。继续培养细胞直到复苏后细胞活性得以确定。

4）在冻存管上标记好细胞名称，编号和冻存日期等信息。然后每管加入1~1.8 ml细胞悬液（视冻存管体积）并密封。

5）室温条件下，将细胞在冻存培养基中平衡15-40 min（勿超）。这段时间中，可以将细胞悬液等分加入冻存管中。40min后，细胞活性可能会受到DMSO的影响而下降。

6）将冻存管置于已预冷至4℃的程序降温盒，并将降温盒置于-70℃（或更冷）的冰箱中至少24小时。或者，使用已预冷至4℃的可编程电子降温系统以1℃/min的速度将冻存管降温至-40℃以下，然后迅速降至-130℃。

7）将冻存管迅速转移至液氮罐或者-130℃冰箱。通常，冷冻的细胞会以10℃/min的速度升温，一旦达到-50℃以上，细胞会剧烈受损。

8）记录冻存位置和过程细节等信息。

9）置于-130℃ 24小时后，取出一只冻存管并复苏，以测定细胞活性和是否污染。

7、冻存细胞复苏

应以最快速度融化冻存的细胞溶液，然后迅速与完全培养基混合，并接种到合适的细胞瓶中。虽然单层培养的细胞可以从多孔板中复苏，但其复苏状态和细胞培养瓶并不一致。

杂交瘤等某些细胞系的完全复苏时间可能需要几天。在复苏的第一天，某些杂交瘤细胞活性较差且会产生细胞碎片。复苏时，多数细胞都会出现活性下降的现象，并在融化后24小时达到活性最低值。即使不是全部，这种活性下降的多数情况可能是由冻存过程中压力变化诱导的凋亡导致的。在这个时间点后，细胞开始恢复并进入指数生长期。

1）准备细胞培养容器（如T-75细胞瓶），加入至少10 ml适当的培养基，并平衡温度及pH。

2）从液氮罐中取出冻存管，并在37℃（或适合该细胞的温度）水浴中缓慢摇动至冰晶彻底融化（约2 min），注意解冻过程要迅速。

3）从水浴中取出冻存管，浸泡入或者喷涂酒精消毒。后续的操作，需在无菌操作台中，并保证严格无菌。

4）拧开冻存管盖，将细胞悬液转移至含有9ml完全培养基的无菌离心管中。温和离心(125g×10min)，弃去上清即冻存保护剂，注意不要扰动细胞层，加入1-2 ml完全培养基重悬细胞。缓慢吹打使细胞团变松散（如果细胞成簇生长，则不要过分吹打）。将细胞悬液转移至含培养基的容器中充分混合。

5）24小时后，检测细胞状态。如果需要，可以进行传代。