动物细胞培养指南（二）

如何更好进行细胞培养

细胞培养和传代

1.细胞代次和倍增水平：

原代的细胞培养一般以1：2的比例扩增（每次传代分成两部分）。大多数连续细胞系以较高的速率复制并且在高分裂比传代。细胞代次是指细胞经过不断传代进入新培养瓶中的传代次数。对于二倍体培养，从培养开始算起，细胞代次基本等同于细胞双倍扩增倍数（群体倍增水平，PDL）。但对于连续细胞系来说，细胞在高分裂比例传代。因此，对于连续细胞系PDL不能确定细胞代次。在大多数情况下，PDL只是一个估计数值，因为无法确定细胞死亡是由于坏死，凋亡，接近衰老还是细胞不再分裂的情况。

2.适应新的培养基或者血清：

为了保证细胞系特性的连续，需保持细胞系在相同培养基和血清中培养，并在传代时以相同的方法补充培养基。培养条件的变化，有可能改变细胞系的特性。

培养一个新的细胞时要特别注意培养基一致性的问题。因为来自于不同厂家的培养基，即使名字相同或类似，配方也略有差异。仔细阅读说明书，配方，标签，确保使用正确的培养基，细胞能适应新的培养基。现有的大部分细胞系的培养条件都可以在ATCC查询到，在细胞信息中都注明了培养基。

如果细胞需要更换血清的时候，建议进行驯化，这样能够更好的保证细胞的特性和状态。如果不驯化的话，有一些敏感的细胞会遇到传代以后不增殖、生长慢、状态差的问题，不过大部分细胞也会在适应3~4代左右恢复状态。

使用下面的程序，使细胞适应新的培养基：

1）以1：2的比例传代到新培养瓶中。

2）在两个培养瓶中，观察细胞生长，对比形态和生长速度的变化。如果相同，传代培养下一代细胞时，细胞1：2分配，培养基采用1：3的比例（25%原培养基，75%新培养基）。

3）观察细胞生长速度，对比原来和现在的细胞形态。传代培养下一代细胞时，细胞1:2分配，培养基采用1：7的比例（12.5%原培养基，87.5%新培养基）。

4）观察细胞生长速度，对比原来和现在的细胞形态。如果形态一致，传代培养下一代细胞时，细胞1：2分配，培养基采用全部新培养基。此时，细胞适应了新的培养基。

3.培养温度：

大多数动物细胞的最佳生长温度在37℃。昆虫和两栖动物细胞需要较低的生长温度(如28℃)，因为一些动物细胞是温度敏感型。而培养的细胞可以承受相当大幅度的降温，大部分细胞可在4℃存活数天，很少量细胞能在超过最佳温度2℃以上，存活几个小时或更长时间。

4.检测培养基：

定期仔细的观察培养基中细胞的形态和活性。肉眼观察细胞培养基，检查是否污染。这包括异常的pH变化(红色变为黄色或紫色)、浑浊度或有无颗粒。同时，仔细检查是否有小真菌菌落，它们漂浮在液体和空气交界面。特别是要检查容器的边缘，因为这些位置不易通过显微镜被检查到。

5.细胞计数：

为了建立或监测细胞生长率，而且为了使已知数量的细胞适应新的培养基，进行细胞计数是很必要的。血细胞计数器通常用于估计细胞数量和确定细胞生存能力。

血细胞计数器是一个较厚的载玻片，有两个计数室，两边各一个。每个计数室有一个镜像表面3×3 mm，9 mm2的正方形网格。盖玻片和载玻片之间有0.1 mm空隙，每9 mm2的格子有0.0001 ml。

血细胞计数器能很好的测定细胞活性，但由于相对较少的细胞数量，所以不能精确测定细胞数。自动计数器将产生最可靠的数据，尤其是在结合血细胞计数器的活性测定数据情况下。

6.细胞活力：

活性分析是检测出总细胞中具有活力的细胞数量。结合细胞的总数分析，有活力的细胞数量是对细胞培养基状态是否良好的一个指标。最常见的和快速的方法，是根据细胞膜的完整性作为细胞活力的指标。台盼蓝和赤藓红B染色法，可根据有无完整细胞膜区分死细胞和活细胞。

虽然两种试剂的染色方式一致，但建议用赤藓红B代替台盼蓝。选用台盼蓝，使用前需孵育细胞2 min至5 min。如果超出这个时间，细胞将开始死亡并着色。赤藓红B不需要孵育。

赤藓红B染色结果更准确，假阴性和假阳性结果更少。赤藓红B染色解决方案提供了一个清晰的背景，不像台盼蓝会结合血清蛋白质，使染色细胞更明显，更容易识别。此外，更容易发现微生物污染或培养基中的沉淀。另外，台盼蓝有毒并且是潜在的致癌物质。

7.传代培养单层贴壁细胞：

为了保证单层贴壁细胞的对数生长，需要定期传代。当细胞生长接近指数生长后期(汇合率大约70%到90%)，准备传代。针对接种过程，一般细胞的产品说明中，会推荐细胞传代分配比例和补充培养基策略。

单层贴壁细胞传代，需要打断细胞之间的连接。对于比较松散的连接，猛击培养瓶侧壁，可以分离细胞。很多情况下，需要胰蛋白酶/EDTA的蛋白水解酶来消化。对于一些细胞系，需要采用刮等机械方法分离细胞。细胞分离成为单细胞悬液后，被稀释到适当的密度并转移到新的培养瓶中，在适当的生长培养基中，细胞将再贴壁生长和分裂。

此程序适合大多数贴壁细胞。然而，由于每种细胞都是独一无二的，孵化时间和温度、清洗次数或溶液配方可能会有所不同。分离过程中，应用显微镜密切观察细胞，以防止细胞损伤。这个过程根据容器使用合适的培养体积。

8.悬浮细胞：

大多数原代细胞、有限传代细胞系和连续传代细胞系都是单层贴壁细胞。其他细胞，尤其是那些来自造血或某些肿瘤组织，是悬浮生长的。

相对于单层贴壁细胞来说，悬浮细胞的传代更具有优势，可以使用稀释的方法来传代。单层贴壁细胞需要蛋白水解酶，会造成细胞损伤。悬浮细胞生长没有延迟。

悬浮细胞对实验室空间要求较小，传代培养是线性放大的。细胞可以在发酵罐中培养，类似于酵母或细菌的发酵罐培养。

根据细胞类型，悬浮培养接种密度从2×104至5× 105活细胞/ml。收获时细胞密度2×106细胞/ml。如果细胞接种密度过低，他们将经历增长延迟阶段，增长非常缓慢甚至完全死亡。如果细胞密度过高，细胞可能耗尽培养基中营养，而突然死去。在细胞说明书中的描述中，都会注明推荐的接种和传代密度、添加培养基方法及培养基配方。

9.在悬浮体系中培养单层贴壁细胞：

L-929 ， HeLa   和 BHK-21细胞系可以适应悬浮体系生长。随时间的推移，其中的一些细胞不会再自身聚集或者贴壁。然而，这些新的细胞系可能失去原代细胞特性或者获得与原代细胞不同的特性。在大多数情况下，使用机械搅拌保持悬浮状态。切记，大多数贴壁细胞如果要进行悬浮培养，体系中需要有微球的帮助。