HyCyte™ 海星生物技术服务指南
| 一、非病毒法——VI RUS-Free™基因导入系统 | 七、载体与病毒 |
| 二、ClonePlus™培养技术 | 八、CRISPR-gRNA文库筛选服务 |
| 三、CRISPR基因编辑技术 | 九、CRISPRa（基因激活）服务 |
| 四、细胞实验服务 | 十、CRISPRi （基因抑制/沉默）服务 |
| 五、CDX动物模型 | 十一、微生物基因编辑服务 |
| 六、PDO类器官 |
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一、非病毒法——VI RUS-Free™基因导入系统
VI RUS-Free™是一种利用转座子系统进行细胞稳转株的构建和筛选的技术。其载体中包括了转座子的识别区域，在转座酶的催化下，将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构，并在基因组里面的特定位置进行插入,从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用，充分体现出其：低成本、高效率、基因表达稳定的特点。
应用范围：
稳转细胞株 | 干扰细胞株 | 敲除细胞株 | 双荧光素酶检测 | 示踪细胞 |
案例：人结直肠癌细胞HCT116/GFP稳转细胞株
| 转染24h 药筛3天后的荧光图片 | 第二次传代后的流式检测GFP表达率 | 第八次传代后的流式检测GFP表达 
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细胞基因片段敲除/ Western Blot有保障
大片段敲除策略：筛选鉴定更简单，敲除效 果更明确,适用于编码基因和非编码基因。 |
二、ClonePlus™培养技术
细胞的克隆形成是一个缓慢而且效率很低的技术过程，但是很多细胞实验都需要经过一个单克隆生长阶段，为了增加细胞株的克隆形成的
效率，我们研发了该款细胞培养基。ClonePlus™培养基含有多种细胞培养添加成分，包括：
海星生物使用ClonePlus™培养基测试多种工程细胞株、肿瘤细胞株、原代细胞株、干细胞株等都能提高20〜150%的克隆形成效率(数据 来自同一株细胞对比)。
DMEM+10%FBS | DMEM+10%FBS+CPs ClorwPlusB培养基促进克隆形成和克隆増殖 |
三、CRISPR基因编辑技术
Cas9蛋白对靶位点的DNA双链进行切割，产生双链断裂(DSB),绝大多数情况下(>80%)，细胞采用NHEJ修复路径，使得靶位点位置随机产生个别碱基的删除或插入(Indel)，当Indel发生编码区域且为非3倍数时，得到基因敲除模型。
极少数情况下(<10%),且细胞内存在同源片段时，细胞采用HDR修复路径，使得靶位 点产生精确修复；在同源片段中引入外源基因片段或者突变碱基，可得到基因定点插入模型或者基因定点突变模型。
四、细胞实验服务
细胞株构建 | 永生化服务 | 干细胞技术服务 |
♦过表达细胞株 | ♦干细胞永生化 | ♦原代提取 |
♦干扰细胞株 | ♦原代细胞永生化 | ♦干细胞流式鉴定 |
♦敲除细胞株 |
| ♦干细胞诱导分化 |
| SD大鼠骨髓间质干永生化细胞株 | Mouse MSC/GFP 稳转株 | human MSC成骨诱导分化 |
细胞增殖 | 侵袭、迁移 | 细胞凋亡 |
♦ CCK8 | ♦ Transwell | ♦流式凋亡检测 |
♦ MTT | ♦划痕 | (Annexin VAPC/7-AAD)
(Annexin VFITC/PI) |
细胞周期 | 药物处理实验 | 双萤光素酶检测 |
♦流式检测（Pl染色） | ♦药物敏感 | ♦启动子活性检测 |
克隆形成 | ♦药物毒性 | ♦miRNA靶点验证 |
细胞共培养 | ♦ IC50 |
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五、CDX动物模型
细胞系异种移植Cell Line-derived Xenograft （CDX）模型，通过将肿瘤细胞株接种到免疫缺陷动物或者人源化免疫系统小鼠体内，形成皮下瘤或者原位瘤，供实验研究使用。可以在小鼠皮下、原位进行，也可使用人源化模型，以评估完整的人类免疫系统内的免疫治疗效果。 | 
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CDX人细胞株模型库（现货） |
细胞名称 | 细胞类型 |
| 细胞名称 | 细胞类型 |
| 细胞名称 | 细胞类型 |
SK-N-BE | 人胶质瘤细胞 |
| THP1 | 人白血病细胞 |
| 1140 | 人脑胶质瘤 |
U118MG | 人胶质瘤细胞 |
| A172 USF1 | 人稳转细胞系 |
| U251 | 人脑胶质瘤细胞 |
A172 | 人胶质瘤细胞 |
| HeLa | 人工具细胞 |
| U87 | 人胶质瘤细胞 |
SK-N-SH | 人胶质瘤细胞 |
| 293T | 人工具细胞 |
| HuH-7 | 人肝癌细胞 |
N87 | 人胃癌细胞 |
| 293T-PDL1 | 人工具细胞 |
| HuH-6 | 人肝母细胞瘤细胞 |
HGC-27 | 人胃癌细胞 |
| Hep3B2.1-7 | 人肝癌细胞 |
| K562 | 人白血病细胞 |
MKN 45 | 人胃癌细胞 |
| Li-7 | 人肝癌细胞 |
| RBE | 人肝胆管癌细胞 |
MCF7 | 人乳腺癌细胞 |
| SK-HEP-1 | 人肝癌细胞 |
| HCCC-9810 | 人胆管细胞型肝癌细胞 |
DU145 | 人前列腺癌 |
| Hep G2 | 人肝癌细胞 |
| Jurkat | 人T淋巴细胞白血病细胞 |
PC-3 | 人前列腺癌 |
| 786-0 | 人原发性透明细胞癌 |
| LNCap | 人前列腺癌细胞 |
SW480 | 人结肠癌 |
| 769-P | 人原发性透明细胞癌 |
| PC-3 | 人前列腺癌细胞 |
HT29 | 人结肠癌 |
| U937 | 人组织细胞淋巴瘤细胞 |
| HL-60 | 人早幼粒白血病细胞 |
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CDX小鼠细胞株模型库（现货） |
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细胞名称 | 细胞类型 |
| 细胞名称 | 细胞类型 |
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L929 | 小鼠成纤维细胞 |
| L.Wnt-3A | 小鼠成纤维细胞 |
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MEF | 鼠成纤维细胞 |
| LLC | 小鼠肺癌细胞 |
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3LL | 小鼠肺癌细胞 |
| B16F10 | 小鼠黑色素瘤细胞 |
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RAW | 小鼠巨噬细胞 |
| EMT-6 | 小鼠乳腺癌细胞 |
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六、PDO类器官
患者来源肿瘤类器官(Patient-derived Organoids，PDO)是一种强化患者与药物筛选相关性的新模型，能够如实地概括其亲代肿瘤的基因组、形态和病理生理学特征。PDO模型与传统的体外模型相比，患者相关性更高，可以加快药物研发速度并降低候选药物的高失败率，已经广泛应用于药物筛选、疾病研究、新药研究等领域。
临床研究表明，类器官在预测药物临床响应性方面，预测药物有效性阳性率88% ，预测药物无效或耐药率100%。
患者衍生的类器盲(PDO)技术流程
案例：肝癌类器官模型检测药物MSJY-01、MSJY-02、MSJY-03活性（周期：15个工作日）
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| HCC-28模型候选药测活结果:MSJY-03敏感,MSJY-02轻度敏感,MSJY-01不敏感。 |
HCC-28模型信息展示 代次：P3代 基因型：ROS1基因重排
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| HE | CDX-2 | KERATIN | 药物敏感/耐药信息 |
| HE染色余免疫组化 | 感药物：索拉菲尼，乐伐替尼，药A，药B；耐药：5-FU，顺铂 |
已有的部分PDO模型:
PDO模型 | 样本名称 | 基因型 | PDO模型 | 样本名称 | 基因型 |
肠癌类器官 | CRC-07 | KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF 野生型 | 肝癌类器官 | HCC-16 | BRAF (V600E) |
CRC-19 | KRAS (G12D) | HCC-28 | R0S1基因重排 |
CRC-26 | KRAS (G12A) , NRAS (Q61R) | HCC33 | EFGR (T790M) |
CRC-39 | PIK3CA (H1447R) | 胃癌类器官 | 胃癌 N01 | HER-2+ |
CRC-31 | KRAS (G13C) | 胃癌N03 | EFGR外显子19缺失 |
肺癌类器官 | 肺癌N03 | EFGR (L858R) | 胰腺癌类器官 | 胰腺癌N02 | BRCA1突变 |
肺癌N06 | R0S1基因重排 | ♦常见癌种的200+例高质量PDO模型库 |
肺癌N07 | KRAS (G12D) | ♦按国际标准进行模型的分子鉴定（NGS）和CAP认证的病理检测 |
七、载体与病毒
真核载体 | 病毒包装 | 现货质粒 | 其他 |
♦过表达载体 | ♦腺相关病毒（AAV） | ♦过表达质粒 | ♦基因突变 |
♦干扰载体 | ♦慢病毒（W） | ♦干扰质粒 | ♦载体改造 |
♦ CRISPR/Cas9 载体 | ♦腺病毒（ADV） | ♦敲除质粒 | ♦文库构建 |
♦ miRNA过表达/干扰载体 | ♦逆转录病毒（RV） |
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八、CRISPR-gRNA文库筛选服务
CRISPR-gRNA文库是高通量筛选靶基因的重要工具，可用于大规模或全基因组功能筛选，涉及信号通路、疾病、细胞药物应答、发育、基因调控等方面。
海星生物在gRNA文库筛选方面拥有丰富的经验，能够帮助客户快速构建CRISRP K0 （基因敲除）、CRISPRa （基因激活）、CRISPRi （基因抑制/沉默）文库等各种文库，也可以为客户提供全套的细胞功能筛选服务，涵括文库构建、病毒文库、细胞转染和筛选、NGS测序与数据分析服务。
服务类型 | 技术原理 | 靶向位置 | 应用 |
CRISPR KO（基因敲除） | 利用野生型Cas9或Cas9切割酶切割DNA。当细胞 自身发生随机修复时， 可以在靶位点引入随机突变。 | 通常是编码区域 | 主要用于编码基因的功能筛选 |
CRISPRa（基因激活） | 转录激活功能域（如VP64）融合无催化活性的Cas9 （dCas9），用于激 活靶位点调节基因表达。 | 通常是启动子区和 其他非编码调控区 | 用于编码基因的功能获得筛选 或非编码区域的调控功能筛选 |
CRISPRi（基因抑制/沉默） | 转录阻遏物（如KRAB）融合无催化活性的Cas9 （dCas9），用于抑制靶 位点调节基因表达。 | 通常是启动子区和 其他非编码调控区 | 编码基因的功能缺失筛选或
非编码区域的调控功能筛选 |
海星生物提供现货Human和Mouse全基因组范围的基因敲除（CRISPR-KO） gRNA文库，靶向特定通路或基因的gRNA订制文库。
九、CRISPRa（基因激活）服务
CRISPRa （基因激活）系统是用于激活内源性基因转录的强大工具，切割失活的Cas9 （dCas9）连上转录激活子（如VP64、p65和HSF1），可以有效促进基因组特定位点的转录。研究显示，CRISPRa技术可以使得基因的转录得到两倍到数干倍的增长，许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。 |
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| 技术优势：通过内源基因组背景进行激活， 激活表达量可以从2倍到几个数量级的提升。 |
具体案例（HEK293 PDGFRB基因激活）
| 样品名称 | ①hPDGFRB | ②hGAPDH | △CT (①-②) | △△CT （实骋组-对照组） | 2-△△CT | 表达量 |
实验组-gRNA1 | 13.031 | 14.511 | -1.479 | -8.322 | 320.09 | 32009% |
实验组-gRNA2 | 13.939 | 15.389 | -1.449 | -8.292 | 313.527 | 31352% |
实验组-gRNA3 | 17.302 | 16.100 | 1.202 | -5.641 | 49.904 | 4990% |
| 病毒转导效果良好，荧光率达80%以上。 | 对照组 | 21.419 | 14.576 | 6.843 | 0 | 1 | 100% |
十、CRISPRi （基因抑制/沉默）服务
CRISPRi（基因抑制/沉默）系统是用于抑制内源性基因转录的强大工具，当没有切割活性的Cas9（dCas9）被引导到靶基因的转录起始位点TSS（transcription start site）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。当dCas9融合了一个基因抑制结构域，如KRAB结构域，这样的蛋白称之为dCas9-KRAB，可以进一步提高转录抑制的效率。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2。 |
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| 技术优势：不改变内源基因组背景、基因抑制效果可筛选、适用更多基因种类。 包括：mRNA、非编码RNA、microRNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III转录本等基因的转录抑制。 |
CRISPRi vs RNAi 研究基因功能最常见的方法是:减少或者阻断基因表达，然后进行表型分析。 CRISPRi和RNAi都是常用的基因表达水平敲低的研究工具。 RNA干扰（RNAi）靶向细胞质中成熟的RNA， 而CRISPRi则在细胞核内阻止转录的起始，因而敲低效果更为显著。 此外，CRISPR的脱靶效应要远远低于RNAi。 | |
十一、微生物基因编辑服务
后基因组时代一项重要的任务是研究并挖掘基因的功能，微生物也一样，即使是模式大肠杆菌仍有一半以上的基因为未知功能。对微生物基因组进行遗传改造，是真正实现驾驭微生物，为我所用的必须步骤。
| CRISPR/Cas9介导的基因敲除/敲入 1. 根据敲除基因序列设计sgRNA序列，构建Cas9-sgRNA敲除载体； 2. 融合PCR扩增，获得重组修复模板（缺失目的基因部分序列）； 3. 将敲除载体和重组修复模板共同转染到细菌内； 4. Cas9-sgRNA复合体对目的基因进行切割,造成双链断裂（DSB）; 5. 细菌利用带有部分目的基因缺失的重组修复模板对DSB进行修复, 获得目的基因敲除菌株。 |
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Red重组介导的基因敲除/敲入 1. 根据敲除基因设计同源臂序列，构建敲除载体1 （含正负压力筛选标记），将敲除载体1转染到细菌内； 2. 在Red重组酶作用下，敲除载体1与目的基因发生同源重组，目的基因被抗性基因替换，通过抗性基因富集敲除菌株； 3. 构建无抗性的敲除载体2，将敲除载体2转染到细菌内； 4. 在Red重组酶作用下，敲除载体2与抗性基因发生同源重组，抗性基因被重组片段替换，通过自杀基因富集无抗性的敲除菌株。 |
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应用范围
大肠杆菌 | 枯草芽孢杆菌 | 假单胞菌 | 肺炎克雷伯菌 | 金黄色葡萄球菌 |
酿酒酵母 | 乳酸菌 | 毕赤酵母 | 假丝酵母 | 曲霉属真菌 |
