MBL-LC3抗体常见问题

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Q1如何进行饥饿诱导？

培养NRK细胞时，可将培养基更换为Hank's Balanced Salt Solution (无血清)培养2~4小时，对细胞 进行饥饿诱导。使用无血清的DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)培兼基虽然也可以地行诱 导，但是由于DMEM培养基中含有氨基酸，因此诱导效果会减弱。另外，对不同种类的细胞进行诱导时， 最适的诱导条件很有可能不同，最好能够针对不同的细胞摸索最适的饥饿诱导条件。

Q2用Western Blotting检测LC3时，比较适合的凝胶浓度是多少？

推荐使用15%浓度的凝胶。如果使用10%浓度的凝胶，LC3-I和LC3-II的条带会重合，难以分辨。

Q3 用Western Blotting检测不到LC3的条带。

参照Data Sheet,确认以下几点。

•制备样品需使用含有SDS的sample buffer。

推荐使用 SDS-PAGE sample buffer (Laemmli's sample buffer)。

•使用单克隆抗体检测LC3时，对转印膜进行封闭后，必须增加一步洗涤的步骤。用0.05% Tween-20/ PBS洗涤3次，每次5分钟，可以使LC3-II条带的信号更强。

•推荐使用human LC3B强行表达细胞的细胞裂解液(货号PM036-PN)作为WB时的阳性对照。

Q4分析WB检测到的LC3-I和LC3-II条带时，是否有相关的参考文献？

请参考下述文献。文献中对LC3的WB结果有详细的说明。

Mizushima, N. and Yoshimori, T., How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3 (6), 542-545 (2007) PMID:17611390 Klionsky, DJ., et aL, Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes, Autophagy 4(2), 151-175(2008) PMID: 18188003

KI ionsky, DJ., et al., Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy, Autophagy 8(4), 445-544 (2012) PMID: 22966490

Q5进行细胞染色实验时，有何注意事项？

推荐使用Digitonin(Sigma, D141)进行穿膜处理，溶剂为PBS (现用现配，终浓度为100 pg/mL)。不推荐 使用Triton X-100进行穿膜处理。

Q6进行细胞染色(IC)时，使用什么方法固定比较好?

推荐使用4% PFA/PBS。不推荐使用甲醇或丙酮进行固定。

Q7进行组织染色(IHC)时，使用什么方法固定比较好？

推荐使用10%福尔马林溶液(福尔马林量为3.7%),或4% PFA/PBS。

Q8是否可用于冷冻切片样品的染色?

我公司未使用冷冻切片样品进行评价。

Q9推荐的抗体有哪些？

使用目的不同，推荐的抗体不同。请参考下述内容。

WB:货号 M186-3、PM036

IP:货号 M152-3、PM036

IC:货号 M152-3、PM036

FCM:货号 M152-3、PM036

IHC:货号 PM036

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