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雅酶-Western blot之 显影检测 二维码
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发表时间:2022-06-02 14:33作者:诺扬生物来源:雅酶 ![]() Western blot环节多,每个细节出现问题都会影响最终的结果。今天带大家了解一些Western blot操作最后一步,显影检测。 Western blot是先通过凝胶电泳将蛋白样品进行分离,然后转印到膜上,再利用抗原抗体的特异性结合对靶蛋白进行检测分析(如下图)。 具体是如何检测呢? 显色检测: 通常用碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗。当底物与酶接触时,转化为沉淀,在膜上形成不溶性有色产物(如图)。显色检测已广泛使用多年,是一种最简单蛋白质印迹检测方法。底物由此产生的条带可以直接观察,不需要特殊设备进行处理或显色。 优点:无需特殊仪器,适合检测高丰度蛋白。 缺点:灵敏度低,产生沉淀物不易剥离再次检测。 显色检测在Western blot中应用的相对较少。 荧光检测: 通常使用荧光染料(如cy2,cy3等)标记二抗。可以得到直接的信号,膜上的靶蛋白浓度与荧光信号呈线性关系,实现真实可靠的定量分析。利用不同发射光谱的荧光染料标记不同种属的二抗,可无需剥离,实现一张印迹膜上的多重检测(如图)。 优点: 1、同一印迹上多重检测; 2、可获得直接信号,线性响应范围更宽,印迹重复性好; 3、归一化更简单。 缺点: 1、灵敏度较化学发光低; 2、需要带有适合滤光片或激光的成像仪器; 3、需要注意避免荧光污染。 荧光检测由于可获得稳定直接信号,结果可靠、重复性好,在Western blot实验中使用越来越多。 化学发光: 通常是用HRP标记二抗。HRP作用于化学发光底物(ECL),使其发射425nm波长光,可通过 X 光胶片(如下图)、CCD 成像系统检测。相比其他用检测方法,化学发光的检测灵敏度最高,目前最高检测灵敏度已经达到低飞克(Femto)-高阿克(Atto)级别。化学发光法可实现多次曝光以获得最佳图像;可剥离抗体并重新检测整个印迹膜,以分析另一个蛋白靶点或优化第一个蛋白靶点的检测结果。 优点: 1、灵敏度高,有多种灵敏度级别的化学发光液可以选择; 2、可剥离重新检测印迹。 缺点: 1、间接光信号,归一化较难,重复性较差。 化学发光目前任然是在Western blot实验中最常用的检测方法。 案例一: 没有信号或者信号很弱 案例二: 背景高 条带无信号 案例三: 反白 空心带 案例四: 显影后膜上出现褐色印迹 案例五: 换了高灵敏度发光液 背景很脏 1、封闭不充分;抗体和封闭液产生交联反应;洗膜不充分;抗体浓度过高。 解决办法:增加封闭时间,优化封闭液浓度;更换其他类型封闭液;增加洗膜次数延长时间;降低抗体浓度。 2、化学发光液:灵敏度高的化学发光液可以检测出更微弱的信号,所以可能导致背景增强。 解决办法:换了灵敏度高的化学发光液,需要适当降低一抗、二抗的浓度。只有当酶和底物达到合适平衡,才能得到更好的信号,以及获得更低的背景。 / - 小 贴 士 - / 选择一款合适的化学发光液,会让我们的实验事半功倍,那么我们该怎么选择呢? 主要考虑两个因素:灵敏度和信号持续时间。 一般来说,相同量的HRP,灵敏度越高的发光液,发出的信号越强,信号持续的时间越短;灵敏度低的发光液反之。 所以检测表达量高的蛋白,可选择灵敏度低一些的发光液,不容易出现信号消失过快、反白等现象;检测表达量低的蛋白,可选择灵敏度高的发光液,更容易检测出信号。 另外当我们更换不同灵敏度的发光液时,需要进一步优化我们的体系才能得到更好的结果。
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