雅酶-Western blot之 显影检测

    显色检测：

      通常用碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗。当底物与酶接触时，转化为沉淀，在膜上形成不溶性有色产物(如图)。显色检测已广泛使用多年，是一种最简单蛋白质印迹检测方法。底物由此产生的条带可以直接观察，不需要特殊设备进行处理或显色。

优点：无需特殊仪器，适合检测高丰度蛋白。

缺点：灵敏度低，产生沉淀物不易剥离再次检测。

显色检测在Western blot中应用的相对较少。

    荧光检测：

      通常使用荧光染料(如cy2,cy3等)标记二抗。可以得到直接的信号，膜上的靶蛋白浓度与荧光信号呈线性关系，实现真实可靠的定量分析。利用不同发射光谱的荧光染料标记不同种属的二抗，可无需剥离，实现一张印迹膜上的多重检测(如图)。

优点：

1、同一印迹上多重检测；

2、可获得直接信号，线性响应范围更宽，印迹重复性好；

3、归一化更简单。

缺点：

1、灵敏度较化学发光低；

2、需要带有适合滤光片或激光的成像仪器；

3、需要注意避免荧光污染。

荧光检测由于可获得稳定直接信号，结果可靠、重复性好，在Western blot实验中使用越来越多。

    化学发光：

      通常是用HRP标记二抗。HRP作用于化学发光底物(ECL)，使其发射425nm波长光，可通过 X 光胶片(如下图)、CCD 成像系统检测。相比其他用检测方法，化学发光的检测灵敏度最高，目前最高检测灵敏度已经达到低飞克(Femto)-高阿克(Atto)级别。化学发光法可实现多次曝光以获得最佳图像；可剥离抗体并重新检测整个印迹膜，以分析另一个蛋白靶点或优化第一个蛋白靶点的检测结果。

优点：

1、灵敏度高，有多种灵敏度级别的化学发光液可以选择；

2、可剥离重新检测印迹。

缺点：

1、间接光信号，归一化较难，重复性较差。

化学发光目前任然是在Western blot实验中最常用的检测方法。

案例一：

    没有信号或者信号很弱

案例二：

    背景高 条带无信号

案例三：

    反白 空心带

案例四：

    显影后膜上出现褐色印迹

案例五：

    换了高灵敏度发光液 背景很脏

1、封闭不充分；抗体和封闭液产生交联反应；洗膜不充分；抗体浓度过高。

解决办法：增加封闭时间，优化封闭液浓度；更换其他类型封闭液；增加洗膜次数延长时间；降低抗体浓度。

2、化学发光液：灵敏度高的化学发光液可以检测出更微弱的信号，所以可能导致背景增强。

解决办法：换了灵敏度高的化学发光液，需要适当降低一抗、二抗的浓度。只有当酶和底物达到合适平衡，才能得到更好的信号，以及获得更低的背景。