概述蛋白质印迹（Western Blot，WB）又称免疫印迹，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
WB实验流程图
|
WB样品制备指南样品制备是WB的关键步骤。适当的样品处理方式可确保您能够检测到目标蛋白。以下是WB样品制备的一般操作方法。 【细胞】 1. 分离细胞：使用预冷的PBS洗涤并分离细胞。对于贴壁细胞，使用细胞刮/消化液令细胞脱落。 对于悬浮细胞，离心悬浮液以分离细胞沉淀。
2. 细胞裂解：使用添加了蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。
3. 超声破碎：上述细胞样品放置于冰上，低强度、短促超声处理以破坏细胞膜结构，同时可以避免蛋白大量变性。
4. 离心：超声处理的裂解物于4℃低温离心，并收集上清液。
5. 蛋白质定量：使用Bradford法检测蛋白质浓度。
6. 样品稀释和热处理：蛋白质定量后，用凝胶上样缓冲液/样品缓冲液稀释样品，并在95-100°C加热5-10分钟。
【组织样本】 1. 均质化：将较小的实体组织浸入预冷的裂解缓冲液中，并使用电动均质器均质化。对于较大的组织样品，使用搅拌器将组织在PBS中匀浆，然后用裂解缓冲液处理以破坏细胞膜。
2. 超声破碎：上述细胞样品放置于冰上，低强度、短促超声处理以破坏细胞膜结构，同时可以避免蛋白大量变性。
3. 离心：超声处理的裂解物于4℃低温离心，并收集上清液。
4. 蛋白质定量：使用Bradford法估算蛋白质浓度。
5. 样品稀释和热处理：蛋白质估计后，用凝胶上样缓冲液/样品缓冲液稀释样品，并在95-100°C加热5-10分钟。 |
WB常见问题及解决方案
| 问题 | 可能原因 | 验证或解决办法 |
|---|
| 条带背景较高 | 未进行非特异性封闭或封闭不充分 | 延长封闭时间，更换封闭剂 |
| 一抗浓度过高 | 增大一抗稀释倍数 |
| 抗体孵育温度过高 | 4℃孵育 |
| 二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应 | 在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如Tween-20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用BSA代替奶粉作为封闭剂 |
| 一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 | 在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交叉反应 |
| 膜不结合 | NC膜比PVDF膜背景低 |
| 未结合蛋白质洗涤不充分 | 增加洗涤次数 |
| 缓冲液污染 | 尽量使用新配置的缓冲液 |
| 膜干燥 | 保证充分的反应液，避免出现干膜 |
| 阳性条带弱或没有信号 | 一抗、二抗等不匹配 | 订购试剂之前确认样品的种属来源，二抗的反应种属与一抗的种属来源相匹配 |
| 抗体的浓度低，孵育时间短 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 | 封闭时使用温和的去污剂，如Tween-20或更换封闭剂 |
| 抗原量不足或者蛋白样品降解 | 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本中没有则可能是标本中不含靶蛋白或是靶蛋白的含量太低，后者可增加标本的上样量至30ug每孔，尽量使用新鲜的样本组织，样本制备时需要使用蛋白酶抑制剂或分级提取目的蛋白需要查阅文献确认样品中目的蛋白的表达量 |
| 转膜不充分或洗膜过度 | 使用丽春红检测转膜结果，PVDF膜需要浸润，勿过度洗膜 |
| 过度封闭 | 使用含0.5%的脱脂奶粉，减少封闭时间 |
| 一抗失效 | 使用有效期内抗体，分装保存，避免反复冻融，工作液现配现用 |
| 二抗受叠氮钠抑制 | 所有的溶液和容器中避免含叠氮化钠（HRP的抑制剂），叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。 |
| 酶和底物失效 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活，选择在有效期内、有活性的酶联物，使用新鲜的底物 |
| 曝光时间短 | 延长曝光时间 |
| 一抗不识别检测物种的蛋白 | 参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照 |
| 组织中目的蛋白含量低 | 查阅NCBI或相关文献，确认样品中目的蛋白的含量高低，浓缩使信号最大化（例如检测核蛋白要用核裂解物）。 |
| 胶和膜放反了，如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。 | 对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极 |
| 转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说，蛋白越大，转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。 | 用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中也几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。 |
| 检测系统缺乏足够的灵敏度 | 确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内：
辣根过氧化物酶 500pg/band
碱性磷酸酶 100pg/band
增强的碱性磷酸酶 5pg/band
化学发光 10pg/band |
| 出现多条非特异性条带或条带位置发生错误 | 细胞传代次数过多 | 使用原始或传代少的细胞株，或平行实验 |
| 体内表达的蛋白样本具有多种修饰：乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化和糖基化 | 查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小 |
| 蛋白样本降解 | 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 |
| 新蛋白或同族蛋白分享同种表位的不同剪接方式 | 查阅文献，或blast 搜索，使用说明书报导的细胞株或组织 |
| 一抗浓度过高 | 降低抗体浓度 |
| 二抗浓度过高，产生非特性结合 | 降低抗体浓度，选择特异性更强，只针对重链的二抗 |
| 抗体未纯化 | 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带 |
| 蛋白存在二聚体或多聚体 | SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10min，以增强蛋白质解聚变性 |
| 背景有白色或黑色斑点 | 转膜时有气泡或抗体分布不均匀 | 尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动 |
| 膜激活不完全不均一 | 要完全浸泡 |
| 抗体与封闭剂结合 | 过滤封闭剂 |
| 条带黑色部分内部出现白色区域 | 一抗或二抗加入过多 | 稀释抗体浓度 |
| 显色底物过度消耗或是过曝 | 减少样品上样量、改用低灵敏度的底物、减少曝光时间 |
| 目的条带的位置过高或过低 | SDS-PAGE的胶浓度选择不合适 | 调整胶浓度，分子量大的蛋白选择低浓度胶 |
| 条带向下弯曲，呈“微笑”形状 | 迁移过快，电泳温度过高 | 降低电泳速度，低温电泳 |
| 转膜不充分 | 膜没有完全均匀湿透 | 使用100%的甲醇浸润膜 |
| 靶蛋白分子量小于100Kda | 使用小孔径膜，缩短转膜时间 |
| 靶蛋白的等电点接近转移缓冲液的PH值 | 更换缓冲液，换成CAPS缓冲液或是乙酸缓冲液 |
| 甲醇浓度过高 | 过高的甲醇浓度会导致蛋白质和SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时也会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分量蛋白的转移，降低甲醇的浓度或使用乙醇 |
| 转移时间不够 | 延长转膜时间 |
其他相关链接：
Western Blot：
（产品专题）色彩缤纷的蛋白marker专辑： http://www.ny-bio.com/nd.jsp?id=495#_jcp=4_18
（精品推荐）国产ECL化学发光底物完美替代进口同类产品！：http://www.ny-bio.com/nd.jsp?id=128#_jcp=4_25
（精品推荐）四正柏内参及标签抗体精选锦集：http://www.ny-bio.com/nd.jsp?id=124#_jcp=4_25
（精品推荐）四正柏一抗精选锦集：http://www.ny-bio.com/nd.jsp?id=125#_jcp=4_25
（知识专题）Western Blot技术简介（四正柏整理）：http://www.ny-bio.com/cn/nd.jsp?id=1029
（产品专题）四正柏Western Blot全系列产品：http://www.ny-bio.com/cn/nd.jsp?id=1030
