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正能:WB蛋白免疫印记常见问题与解决方案

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发表时间:2024-06-05 10:17作者:诺扬生物来源:正能

原因-1. 膜上根本没有蛋白

获取样本后,蛋白提取失败且未进行蛋白浓度检测。

处理方法

使用BCA法、Folin酚法、Bradford法等方法进行样本蛋白浓度检测,保证样本提取成功。

原因-2. 样本中不表达目标蛋白

对样本中蛋白表达情况并不是很熟悉,可能需要检测的目标蛋白在样本中根本就没有表达。

处理方法

在参考文献或Uniprot/NCBI上查找对应蛋白的组织表达特异性,分析可能的表达量,判断自己样本中的表达情况。

原因-3. 抗体未结合/抗体失效/一二抗不匹配

一抗鼠源,二抗却选了山羊抗兔;抗体与靶标结合失败;抗体存放不当或存放过久导致失效。

处理方法

重新选择配对的一二抗;买其他品牌的相同靶标抗体对照试验;将该抗体和样本寄回厂家进行质检。

原因-4. 转膜效率低/失败

膜没有完全活化/靶蛋白分子量小于 10 kd/靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值/甲醇浓度过高,蛋白沉淀/转膜时间不够

处理方法

使用甲醇充分浸透膜,成半透明状后取出,保证其完全活化;选择小孔径的膜,缩短转膜时间;可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液(pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液;降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替;对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转膜时间。


原因-1. 封闭不完全

膜的空白部分结合了一抗,导致二抗的非特异性结合,显影曝光导致高背景。

处理方法

延长封闭时间。

原因-2. 一抗/二抗浓度过高

一抗/二抗浓度过高,导致其与背景特异性结合。

处理方法

梯度稀释各试剂进行预实验,找到最优体系。

原因-3. 封闭剂选择错误

不合适的封闭剂会导致抗体在背景上与封闭剂非特异性结合。

处理方法

更改封闭剂种类。

原因-4. 膜处理不当

因为操作不当导致的膜污染/一抗洗脱不完全导致的的高背景。

处理方法

提高实验技巧,完善实验细节;增加洗脱时间,必要时可加入tween-20。


原因-1. 目标蛋白具有多种修饰形式

磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化等不同修饰作用在同一关键通路枢纽靶标上,此为正常结果。

原因-2. 蛋白表位相似但结构不同

新检测出文献未报到蛋白/同一家族蛋白构型不同/细胞株纯度不够,接受该结果作为分析对象。

原因-3. 细胞传代过多,蛋白表达异常

多次传代发生基因组紊乱,二倍体消失或其他编码表达异常的现象。

原因-4. 多克隆抗体

因为操作不当导致的膜污染/一抗洗脱不完全导致的的高背景。

处理方法

如果杂带和目标条带距离较远可以进行裁膜处理,如果杂带和目标条带较近无法通过裁膜避免,则需要更换单克隆抗体。

原因-1.抗体对于目标蛋白没有特异性

抗体与蛋白非特异性结合。

处理方法

更换抗体。

原因-2.蛋白降解

蛋白在提取过程中出现了降解的情况,导致实验失败或非特异性条带出现,通常会同时出现内参条带不清晰的情况。

处理方法

使用新鲜制备的标本,并使用新配蛋白酶抑制剂,在提取蛋白的过程中全程冰上操作。


原因-1.抗体与封闭剂非特异性结合

封闭剂有杂质,或脱脂奶粉未溶解完全。

处理方法

增加封闭后的洗涤时间。

原因-2.抗体凝胶非特异性结合

转膜之后膜上残留的凝胶颗粒与抗体非特异性结合。

处理方法

增加封闭后的洗涤时间。

微笑条带

电泳速度过快 ,电压过高,电泳温度过高,使得胶变形。


处理方法


通过减少电压等减慢电泳速度,可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH。

皱眉条带

凝胶和玻璃挡板底部有气泡,挡板两边聚合不完全。



处理方法


配胶时充分混匀,排空空气。

某条条带变形

WB结果中其它条带均正常,某条条带出现变形,如下图所示,出现该现象可能的原因是SDS-PAGE胶中有气泡或者不溶性颗粒。


处理方法


配胶过程中要小心,使用无杂质的液体,同时要注意排除气泡。

哑铃状条带

配置胶有问题,胶凝固后不均一,样品可能含有过多杂质。


处理方法


重新配置胶,确保胶质量无问题来避免该现象出现;在样品使用前对其进行离心,以去除过多杂质。

条带粘连

出现该现象的原因可能是上样量太多,分离胶和浓缩胶之间有间隙,样品窜孔。



处理方法


通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。

条带拖尾

样本中蛋白溶解不好,导致检测结果出现严重的拖尾现象。



处理方法


加样前煮沸样品,离心取上清进行检测。

条带中间或周围出现白圈

条带中间白圈是由于转膜过程中膜和胶之间存在气泡。



处理方法


在转膜过程中要尽量去除气泡,使膜,滤纸和胶紧密结合,保持膜的充分浸润。

条带反白现象

一抗浓度过高,二抗上HRP催化活力太强,局部能量消耗过大,导致能量不足,无法发光,使得条带出现反白现象。



处理方法


降低一抗和二抗浓度。



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