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四正柏:流式样品制备操作指南

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发表时间:2024-05-29 10:08作者:诺扬生物来源:四正柏

流式实验包括实验设计、样品制备、样品染色、样品读取/分析四个步骤,其中样品制备是流式实验的一个重要步骤,影响实验结果的准确性和实验数据的美观性。

流式细胞术实验流程


单细胞悬液是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。制备过程中,它既要求组织分散成为单个细胞,又要维持细胞的固有属性及生物学特性。外周血细胞或悬浮生长的细胞最适合流式分析,其他样本类型在制备过程中可用的方案较多,本文总结了4种流式样品制备成单细胞样品的实验步骤,供您参考。

01

外周全血

流式实验中常采用EDTA或肝素钠抗凝的外周全血。处理方法:1)用溶血素裂解红细胞;2)用Ficoll或Percoll从外周全血中分离PBMCs,从对应密度层获得目的细胞进行清洗和染色。


1.1外周全血裂红实验方案

    1.1.1. 裂红洗涤方案

  1. 将适量的表面抗体加至抗凝全血中,室温孵育15min;

  2. 加入1×红细胞裂解液,室温避光孵育10min,300-400×g离心 5min,去上清;

  3. 加入PBS/流式细胞染色缓冲液,混匀;

  4. 按上述条件再次离心并将沉淀分散在PBS/流式细胞染色缓冲液中;

  5. 3h内上机检测(若不能立刻上机,用500ul 4%多聚甲醛重悬细胞,4℃避光保存,24h内上机分析)。


    1.1.2. 裂红免洗方案

  1. 将适量的表面抗体加至抗凝全血中,室温孵育15min;

  2. 加入1×红细胞裂解液,室温避光孵育10min;

  3. 混匀,上机检测。

图1:外周全血裂红后双参数点图


1.2 外周血单个核细胞分离

  1. 用无菌稀释液将血样稀释2-4倍;

  2. 在50mL锥底离心管中先加入15-20mL分离液,然后缓慢加入20-30mL经稀释的全血或组织细胞悬液至分离液液面之上;

  3. 室温400×g离心15-30min,保证转子速度平稳下降;

  4. 将离心管小心地从离心机中取出,缓缓地吸去最上层,避免接触单个核细胞层;

  5. 将单个核细胞层缓慢转移到另一只50mL锥底离心管中;

  6. 加入无菌洗涤液并混匀后,室温300×g离心10min,小心弃掉上清;

  7. 为去除残余血小板,可将细胞重悬于30-50mL无菌洗涤液中,室温200×g离心10-15min,弃上清;

  8. 可选择性重复步骤7,以去除绝大部分血小板;

  9. 用缓冲液或培养基重悬细胞,进行检测、培养等后续操作。

     注:骨髓样本的实验步骤同外周全血。

图2:人单个核细胞分离液分离(Ficoll配置)外周全血示意图


1.3 外周血中血小板富集的血浆制备

  1. 取适量体积血液于25℃下300×离心10min;

  2. 将离心后获得的血浆层,于25℃ 1600×g离心10min;

  3. 弃上清,沉淀重悬于Tyrode’s缓冲液或含EDTA的缓冲液中,进行下游实验。


02

培养细胞

图3:贴壁细胞流式表面染色示意图


03

组织

3.1 淋巴组织

  1. 脾、胸腺或淋巴结采集到含缓冲液或培养基的细胞培养皿中,用注射器活塞在细胞筛网上研磨;

  2. 使用PBS冲洗细胞滤网,滤掉细胞团块和碎片;

  3. 4˚C 300-400×g离心5min,弃上清;

  4. 用适当体积的缓冲液重悬细胞,进行细胞计数和活性检测,并调整细胞浓度至107个/mL,进行下游实验。

更多的组织类型及酶选择请参考下面的网站:

https://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html


参考文献



01

WMa,WCui,QLin.Improved immnunophenotyping of lymphocytes in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) by flow cytometry. Clin Chim Acta.2001 Nov;313(1-2):133-8.


02

Jayne S Sutherland, Danlani Garba, Augustin E Fombah,etal. Highly accurate diagnosis of pleural tuberculosis by immunological analysis of the pleural effusion. PLoS One.2012;7(1):e30324.


03

Mickaël Bourge, Spencer C. Brown,etal. Flow cytometry as tool in plant sciences, with emphasis on genome size and ploidy level assessment. Genetics & Applications Vol.2|No.2|December, 2018.


04

Lynn G. Dressler and Dan Visscher. Handling, Storage, and Preparation of Human Tissues, Current Protocols in Cytometry (1997) 5.2.1-5.2.15

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