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海星生物:CRISPR screening—sgRNA pool构建流程

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发表时间:2024-05-24 11:00作者:诺扬生物来源:海星生物
CRISPR Screening是一种专门用于基因功能缺失/激活的大规模功能筛选策略。以针对基因的敲除的CRISPR Screening为例,可以针对全基因组或者选定的基因组合进行sgRNA的高通量设计构建,获得sgRNA cells library,通过分析表型优势细胞中sgRNA的富集程度,即可以筛选到促进和抑制相应表型的基因。
随着CRISPR/Cas9的发展,基于Cas9以及CRISPRi和CRISPRa的筛选策略也被开发出来,并广泛用于耐药基因筛选,功能基因研究等。
最新的单细胞CRISPR筛选平台将读数扩展到转录组,并能够推断基因调控网络,以获得更好的机制见解。
结合CRISPR转基因鼠以及aav病毒的靶向表达递送技术,可以在体内实现组织特异性的CRISPR Screening。
sgRNA pool 除了运用于CRISPR/Cas9系统,也适用于CRISPRi及CRISPRa。CasX/Cas12/Cas13,以及突变体文库,均可通过类似CRISPR/Cas9 Screening的策略实现高通量筛选。


sgRNA pool构建流程



| CRISPR Screening基因组合的确定

sgRNA全基因组文库由于基因数量过多,通常很难获得较好的文库筛选结果。权阳生物建议根据自身的研究方向定制或者购买符合需求的sgRNA亚文库现货,建议基因数量选择在500-2000之间,sgRNA条数每个基因选择5-10条,这样大小的文库更容易得到理想的实验结果。

那么如何选择sgRNA亚文库,通常可结合自身的研究方向选择已有的现货文库,该方式的性价比最高,例如权阳生物目前已经构建完成了RBP/泛素化/转录因子/膜蛋白/表观遗传等相关的CRISPR-cas9 sgRNA libarary,这些文库可以快速运营用相关的课题研究。

但已有的现货文库缺少个性化属性,通常发文也有受到一定的限制!可根据自身的课题方向,结合临床样本的转录组分析结果,制定一个个性化的基因List,再构建至最符合需求的载体上,获得高度定制化的sgRNA 文库,从而完成进行体内外的基因高通量研究,是当下最理想的实验方案。

| sgRNA pool 的设计

| sgRNA pool 的 oligo 的设计

我们以cas9-sgRNA靶点TTCGCACGATTGCACCTTGG为例,引物序如下

CTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-TTCGCACGATTGCACCTTGG-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG

在sgRNA的两端设计合适的同源臂序列,方便后续的PCR扩增及无缝克隆至目标载体。

| sgRNA pool构建步骤

a. 载体处理

通常需要先抽提获得高纯度的目的质粒载体,这样才可以保证后续线性化载体后的纯度能够符合构建文库的要求,获得高纯度的线性化载体是文库构建成功与否的关键环节。

b. sgRNA oligo pool的合成

sgRNA oligo pool 是通过芯片引物合成仪器合成的,oligo池的质量也是决定文库质量的重要因素,因此oligo池在合成之后,我们都通过NGS对其进行QC验证。

c. sgRNA oligo pool的扩增

芯片合成的oligo pool是极微量的单链DNA,通常需要进行PCR扩增获得足够量的双链DNA产物,用于后续和载体的无缝链接。以下述CAS9-sgRNA文库的序列为例CTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-TTCGCACGATTGCACCTTGG-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG的扩增引物

sgRNApool-F:CTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG

sgRNApool-R:CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCT

d. 链接小试

扩增纯化好的sgRNApool PCR产物,按照合适的浓度和目的载体进行链接测试,通常我们会测试3个不同的浓度比例,选择重组子最多的测试组挑菌菌检,通过sanger测序判断样品链接的阳性率和链接效率是否达标。


e. 大体系链接及电转

小试测试通过后,按照小试的样品比例进行大体系的重组链接,链接后纯化链接产物进行电转化,取电转产物稀释涂平板判断重组子数量。该步骤是为了判断构建时的覆盖度是否达标,一般要求构建的重组克隆子数量是文库oligo条数的200x以上。如下图,计算的重组子数量为1E+06,该文库的oligo条数为5E+03,实测的覆盖度为500X。


f. 质粒大抽

电转的文库产物当日进行扩增抽提,一般过夜摇菌,温度可适当降低,防止菌液增殖过快影响质粒质量,次日按照去内毒素大抽试剂盒流程抽提文库质粒,抽提后电泳检测质粒纯度。

g. NGS测序

利用FastNGS测序平台,可以快速检测并分析sgRNA文库的靶基因丰度和平衡性。大大缩短了文库的验证周期。


| 文库合格指标

(1) 覆盖度大于95% : 过滤后最终得到的sgRNA数占sgRNA参考序列数百分比,如果覆盖度越接近100%,说明文库质量越高;

(2) 均一性小于15:表示累计分布达到90% 时对应的sgRNA数目与累计分布达到10% 时对应的sgRNA数目的比值小于15。

a. 病毒包装

构建好的sgRNA文库,根据其病毒骨架特征,可包装成慢病毒或aav病毒,以感染目的细胞及组织。

b. sgRNA细胞/组织文库的构建

通常sgRNA文库使用慢病毒递送的方式较多,包装好的sgRNA文库慢病毒,需要在293T细胞测试其滴度,再感染目的细胞构建细胞文库。通常控制感染比例在30-50%之间为最佳,即MOI大致为0.5,这里的MOI 0.5指的是目的细胞的感染复数,大多数细胞的感染难度要远高于293T细胞,因此构建细胞文库前,必须要测试病毒在目的细胞的MOI。低MOI感染的目的是尽量让每个细胞中只有一个sgRNA序列被插入,这样更方便后续的表型分析。

覆盖度也是构建sgRNA细胞文库的核心指标,通常要求其覆盖度要在200x以上,即计算的初始感染细胞数量要是sgRNA文库oligo总条数的200x以上。例如1000条sgRNA构建细胞文库,那么我们需要至少被感染上的初始细胞数量为2E+05个细胞,要控制MOI在0.5左右,因此我们需要至少4E+05个细胞被感染细胞,加入目的细胞MOI为0.5的病毒量进行感染。

c. aav病毒载体的sgRNA文库,通常运用于体内感染,一般会选择Cre-Loxp的Crispr小鼠模型进行实验,结合特异性启动子表达CRE酶,实现在特定组织上的CRISPR   screnning。


海星生物一站式CRISPR文库筛选方案,包括sgRNA文库定制、文库质粒构建、文库质粒慢病毒包装、CRISPR文库筛选、高通量测序与生信分析。还有大量现货人和小鼠的全基因组敲除文库。
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