| 电泳中的问题 |
| 出现问题 |
| 原因 |
| 条带呈笑脸状(︶) |
| 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好
迁移过快，电泳系统温度偏高 |
| 条带呈皱眉状(︵) |
| 可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡或者凝胶两边聚合不完全 |
| 拖尾 |
| 样品溶解不好 |
| 纹理（纵向条纹） |
| 样品中含有不溶性颗粒，电泳前将样品离心去除颗粒 |
| 条带偏斜 |
| 电极不平衡或者加样位置偏斜 |
| 条带两边扩散 |
| 加样量过多 |
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| Western blot结果中背景高且不均匀 |
| 可能的原因 |
| 建议 |
| 抗体浓度太高 |
| 一抗或二抗浓度太高会导致高背景，增加抗体稀释倍数 |
| 一抗孵育的温度偏高 |
| 建议4℃结合过夜 |
| 使用的封闭液不兼容 |
| 对比不同的封闭缓冲液 |
| 非特异性位点封闭不足 |
| 优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性；
提高封闭液中蛋白的浓度；
优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1h或者4°C封闭过夜；
在封闭液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为0.05%。 |
| 封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 |
| 换一种不同的封闭液；
不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素；
交叉反应的检测：封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光底物检测。 |
| 洗膜不充分 |
| 降低HRP结合物的浓度；
增加洗涤次数和使用洗膜缓冲液的体积；
如果洗涤液中无Tween-20，添加Tween-20使其终浓度为0.05%。 |
| 膜在实验过程中干过 |
| 实验过程中要注意保持膜的湿润 |
| 选择的膜容易产生高背景 |
| 一般硝酸纤维素膜（NC）的背景会比PVDF膜低 |
| 膜的曝光时间过久 |
| 缩短印迹膜曝光到胶片的时间
在孵育过程中始终进行震荡 |
| 膜被污染 |
| 小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合
不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子 |
| 缓冲液污染或结块沉淀 |
| 制备新的缓冲液 |
| HRP处产生聚集体 |
| 用0.2μm过滤器过滤结合物 |
| 结合可产生斑点 |
| 用一种新的高质量的结合物 |
| 缓冲液中有污染 |
| 使用新的缓冲液
缓冲液使用前过滤 |
| 操作设备被污染 |
| 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物
保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景 |
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| Western blot结果中信号弱或无信号 |
| 可能的原因 |
| 建议 |
| 蛋白未转到膜上 |
| 转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率（注：总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原）；
确保转膜过程中胶与膜完全接触；
确保转印夹层排布正确；
确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜；
确保转印部件在电印迹过程中未过热；
使用正对照和/或分子量Marker；
可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流优化转印时间和电流。 |
| 蛋白未完全结合到膜上 |
| 在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。 |
| 一抗、二抗等不匹配 |
| 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物；
可通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性。 |
| 一抗或/和二抗浓度低 |
| 增加抗体浓度；
延长抗体孵育时间；
抗体与靶蛋白的亲和力可能很小；
抗体可能失活；可用斑点印迹检测其活性。 |
| 一抗或/和二抗浓度太高 |
| 使用太多一抗或二抗可能导致底物迅速耗竭，呈现出很弱的信号
至少成倍稀释一抗/二抗（可4-10倍） |
| 一抗失效 |
| 使用有效期内的抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现用现配 |
| 一抗孵育时间不足 |
| 建议4℃结合过夜 |
| 抗体不能识别测试种属的相关蛋白 |
| 购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白 |
| 过度封闭 |
| 使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液；
试用不同的封闭液；
减少封闭时间。 |
| 洗膜过度 |
| 洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.05%的弱去垢剂Tween-20 |
| 缓冲液中含有叠氮钠 |
| 叠氮钠是一种HRP的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂 |
| 曝光时间太短 |
| 延长胶片的曝光时间（注意：超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时） |
| 底物孵育时间太短 |
| 在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育 |
| 酶或底物失活 |
| 超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月，超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月；
为衡量底物的活性，准备一个小量的工作液在一个暗室内，加入少量的HRP结合物，会观察到绿光。如果未检测到光，底物或HRP结合物均有可能失活；
确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降。 |
| 膜可以修复剥离重新用探针检测 |
| 在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性
优化剥离程序
如有必要可重新用探针检测
避免在同一张膜上重复进行探针检测 |
| 在膜上消解抗原 |
| 封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶） |
| 印迹膜保存时蛋白降解 |
| 准备一张新的印迹膜 |
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| Western blot结果中杂带较多或特异性条带位置不对 |
| 可能的原因 |
| 建议 |
| 细胞传代次数过多，使其蛋白表达模式的分化 |
| 使用原始或传代少的细胞株，或平行实验 |
| 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式：乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等，本身可以呈现多条带 |
| 查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小 |
| 目的蛋白有其它剪切本 |
| 查阅文献或生物信息学分析可能性 |
| 样本处理过程中目的蛋白发生降解 |
| 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
样本处理时在冰上操作 |
| 上样量过高，太敏感 |
| 适当减少上样量 |
| 一抗不纯 |
| 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带 |
| 一抗或者二抗浓度偏高 |
| 降低抗体浓度，增加二抗对照
选择特异性更强，只针对重链的二抗 |
| 一抗特异性不高 |
| 重新选择或制备高特异性的抗体 |
| 蛋白存在二聚体或多聚体 |
| SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min，以增强蛋白质解聚变性 |
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