细胞培养问题集

复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。

解冻后的细胞可以直接接种到含有完全培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。

如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。

注：操作时戴好手套，防止冻伤；带上防护眼镜可以防止液氮罐里刚刚拿出来的管子液氮爆炸……

首先得确定现在用的培养基是否适合您的细胞生长。

细胞培养过程中，细胞增殖和形态正常的情况下最好不要更换培养基，细胞都有各自适应的培养基，更换培养条件，细胞可能无法快速适应，导致细胞死亡。

若必须更换，可尝试半换，让细胞逐渐适应新的培养基。

更换培养基的方法：

如果是贴壁生长的细胞， 一般可以直接把培养液吸掉， 再加入新的。加的时候注意不要对着长细胞的那一面。

如果是悬浮型的， 就需要低速离心 （把所有的细胞和培养液转移到离心管里， 或有些离心机配有直接离心细胞培养皿的装置）， 然后再吸掉上清液。加入新的培养液使细胞重新悬浮。

首先要确定更换胎牛血清的理由，如果细胞培养无异常的话，不建议随意更换不同品牌和来源的胎牛血清。

血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的来源（血源地）和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同地域和等级的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞死亡。

如果是使用的胎牛血清出现了问题，比如保存不当或操作不当导致血清成分析出、混浊、污染等情况，可以优先更换同品牌、等级、批次的血清。

如果是产品质量问题更换血清品牌的话，需要用一批细胞进行预实验才行，以保证细胞能够正常培养。

另外大家在购买胎牛血清的时候要选择正规来源和经过海关检疫胎牛血清，非正规来源的胎牛血清有很多安全隐患，对实验室、操作人员、细胞培养、实验数据都有很大的影响。（可以参考底部推荐文章）

收到细胞后先不要开盖，放在培养箱静置若干小时后（看细胞密度而定）在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议对收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各一张），排除细胞本身污染的情况；收到细胞未开封，出现污染状况一般可以再申请免费发送一株细胞。

收到细胞时如无异常情况，请在显微镜下观察细胞密度，如为贴壁细胞，未超过80%汇合度时，将培养瓶中培养液吸出，留下10ml培养液继续培养；超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞，吸出培养液、1000转/分钟离心2分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。

细胞消化液建议使用PBS配制，慎用Hanks液配制。

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

如果是没有进行过细胞培养的新手，对无菌技术没有信心的，或者提取的原代细胞，怕污染的，可以适量添加抗生素。

抗生素本身也是有毒性的，有些抗生素的药效浓度水平与毒效浓度水平非常接近，对细胞多少有伤害。

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5CO2培养细胞。

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

酚红一般作为培养基中pH值的指标：当培养基呈中性时为红色，呈酸性时为黄色，碱性时为紫色。另外，酚红可以模拟类固醇激素（特别是雌激素）的作用。如果要避免类固醇反应，可以在无酚红的培养基里进行培养。

二价的离子会抑制胰酶活性，所以加入EDTA可以螯合掉Ca、Mg这样的二价离子。

胰酶也要注意不要反复冻融哦！

主要还是考虑无菌环境，尽量做好操作台的灭菌，别把培养基滴落在生物安全柜的入风口，别在培养箱里把培养基打翻。这两个地方霉菌一旦滋生，那你就只能等着用甲醛熏蒸了。

紫外无法杀灭霉菌，酒精也不行，只能用甲醛熏蒸，但是一定要注意安全。复苏的时候，水浴锅也需要进行灭菌处理。一旦出现污染，不要急，能救的就用抗生素救一下，但是一般情况下，选择扔掉……

避免交叉感染，要不只能整个实验室消毒了。