四正柏-细胞因子检测-ELISA技术简介

直接法

将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。

优点

■ 操作流程简短，实验步骤少

■ 无需使用二抗避免了交叉反应

■ 实验步骤少，操作不易出错

缺点

■ 实验中的一抗均需直接酶标记，成本相对较高

间接法

将抗原与固相载体连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。

优点

■ 酶标二抗可加强信号，提高灵敏度

■ 灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗

■ 不直标一抗，可保留其最多的免疫反应性

■ 成本更低，使用的标记抗体更少

缺点

■ 交叉反应几率升高

双抗体夹心法

将特异性抗体(通常称为捕获抗体)与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其它未结合物质。加酶标抗体(通常称为检测抗体)，保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。

优点

■ 高特异性，使用的捕获抗体和检测抗体都是检测物特异性的

■ 适用于复杂样品，抗原不需进行纯化即可用于检测

■ 灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法

缺点

■ 检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位

■ 不适用于检测小分子物质

竞争法

竞争法ELISA最为复杂，通常用于检测小分子如半抗原、激素、药物等。样品中待检游离抗原与固定于固相载体上的抗原一起竞争相同的有限量抗体，当样品中的游离抗原越多，就可结合越多的抗体，而固相抗原则只能结合较少的抗体。反之亦然。经洗涤去除样品中抗原与抗体的结合物，只留下固相抗原与抗体的结合物。显色经计算可得样品中抗原的含量。竞争法也可根据实验设置直接法，检测法或夹心法形式。